Bộ kit PCR kỹ thuật số Naica® Droplet Chip phát hiện hiện tượng dị hợp ty thể sau khi chuyển nhân, cho kết quả trong vòng 2,5 giờ.

Bệnh ty thể là một loại rối loạn di truyền do đột biến gen trong bộ gen ty thể (mtDNA) gây ra, chỉ được truyền qua dòng dõi nữ. Thông thường, đột biến ở hơn 60% DNA ty thể trong tế bào có thể dẫn đến bệnh, và càng nhiều đột biến DNA ty thể thì bệnh càng nặng.

Hiện nay, cấy ghép nhân (NT), còn được gọi là hiến tặng ty thể, đang nhận được sự quan tâm ngày càng tăng như một chiến lược để ngăn ngừa các bệnh về ty thể lây truyền từ mẹ sang con. Tuy nhiên, do sự hiện diện của một lượng nhỏ mtDNA có nguồn gốc từ tế bào chất trong quá trình cấy ghép nhân, điều này gây ra sự không đồng nhất và khuếch đại mtDNA ở người nhận, nên việc định lượng chính xác tải lượng đột biến mtDNA là rất cần thiết. Những hạn chế của các phương pháp giải trình tự NGS hiện nay là chi phí cao, thời gian thực hiện lâu, xử lý dữ liệu phức tạp và tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu thấp.

Bệnh thần kinh thị giác di truyền Leber (LHON) là bệnh ty thể di truyền theo dòng mẹ phổ biến nhất. Một nhóm chuyên gia từ Khoa Sinh học thuộc Đại học Ghent ở Bỉ đã sử dụng nền tảng PCR kỹ thuật số (dPCR) để phát hiện vị trí đột biến m.11778 G>A liên quan đến LHON, và so sánh nó với phương pháp NGS để khám phá khả năng ứng dụng của PCR kỹ thuật số trong định lượng tính không đồng nhất của mtDNA. Kết quả nghiên cứu đã được công bố trên tạp chí danh tiếng Clinical Chemistry.

Để đánh giá khả năng ứng dụng của dPCR trong việc đánh giá tính không đồng nhất, ba loại mẫu đã được thiết lập: (i) 13 mẫu từ bệnh nhân có gánh nặng đột biến cao; (ii) Ba mẫu kiểu hoang dã đồng nhất được hiến tặng bởi những người tình nguyện khỏe mạnh; (iii) Các mẫu được xử lý bằng NT mang tải lượng đột biến thấp do dư lượng mtDNA, tổng cộng 6 mẫu.

Phương pháp kiểm tra:

Bằng cách xử lý, phạm vi tải đột biến mẫu được thiết lập ở mức 50% đến 0,01% để phân tích và xác nhận.

Kết luận thí nghiệm:

Tỷ lệ đột biến quan sát được trong kết quả dPCR và NGS cho thấy sự nhất quán tốt.

So với NGS, dPCR có độ nhiễu nền thấp hơn. Sử dụng hệ thống PCR kỹ thuật số chip giọt Naica® cho thấy không có tín hiệu dương tính nào đối với các alen đột biến trong các mẫu không phải của bệnh nhân, đúng như dự đoán.

So sánh với kết quả dPCR, tần số alen thứ cấp của hầu hết các mẫu không đồng nhất đều bị đánh giá quá cao trong kết quả NGS. Giả thuyết ban đầu cho rằng các trình tự không chính xác có thể đã được đưa vào trong quá trình thí nghiệm NGS, và tần số alen thứ cấp đã bị thay đổi thông qua khuếch đại PCR.

So với NGS, PCR kỹ thuật số có chi phí thấp hơn, thao tác đơn giản hơn, cho kết quả trực quan hơn và phù hợp hơn cho việc phát hiện đột biến tần suất thấp.

Phương pháp PCR kỹ thuật số thích hợp cho việc phát hiện định lượng sự không đồng nhất của ty thể sau khi cấy ghép nhân.