naica® Damlacık Çip Dijital PCR, Nükleer Transfer Sonrası Mitokondriyal Heteroplazmiyi Tespit Ederek 2,5 Saatte Sonuç Veriyor

Mitokondriyal hastalıklar, mitokondriyal genomda (mtDNA) meydana gelen genetik mutasyonlardan kaynaklanan ve yalnızca dişi soylardan aktarılan bir tür genetik bozukluktur. Genellikle hücrelerdeki mitokondriyal DNA'nın %60'ından fazlasındaki mutasyonlar hastalıklara yol açabilir ve bir kişide ne kadar çok mitokondriyal DNA mutasyonu varsa, hastalığı o kadar şiddetli olur.

Günümüzde, mitokondriyal hastalıkların hasta annelerden çocuklarına geçmesini önlemek için bir strateji olarak nükleer transfer (NT), diğer adıyla mitokondriyal bağış, giderek daha fazla ilgi görmektedir. Bununla birlikte, nükleer transplantasyonda sitoplazmik kaynaklı az miktarda mtDNA'nın bulunması ve bu durumun alıcıda mtDNA heterojenliğine ve amplifikasyonuna aracılık etmesi nedeniyle, mtDNA mutasyon yükünün doğru bir şekilde ölçülmesi gerekmektedir. Mevcut NGS sekanslama yöntemlerinin sınırlamaları arasında yüksek maliyet, uzun zaman tüketimi, karmaşık veri işleme ve düşük sinyal-gürültü oranı yer almaktadır.

Leber kalıtsal optik nöropatisi (LHON), en yaygın anneden kalıtılan mitokondriyal hastalıktır. Belçika'daki Ghent Üniversitesi Biyoloji Bölümü'nden bir uzman ekibi, LHON ile ilişkili m.11778 G>A mutasyon bölgesini tespit etmek için dijital PCR (dPCR) platformunu kullandı ve dijital PCR'ın mtDNA heterojenitesinin nicelendirilmesindeki uygulanabilirliğini araştırmak için bunu NGS yöntemiyle karşılaştırdı. Araştırma sonuçları, saygın Clinical Chemistry dergisinde yayınlandı.

Heterojenite değerlendirmesinde dPCR'nin uygulanabilirliğini değerlendirmek için üç tip örnek oluşturuldu: (i) Yüksek mutasyon yüküne sahip hastalardan alınan 13 örnek; (ii) Sağlıklı gönüllüler tarafından bağışlanan üç homojen vahşi tip örnek; (iii) NT ile işlem görmüş ve mtDNA kalıntısı nedeniyle düşük mutasyon yükü taşıyan toplam 6 örnek.

Test yöntemi:

İşlem sonucunda, analiz ve doğrulama için örnek mutasyon yükü aralığı %50 ile %0,01 arasında belirlenir.

Deneysel sonuç:

dPCR ve NGS sonuçlarında gözlemlenen mutasyon oranları iyi bir tutarlılık gösterdi.

NGS'ye kıyasla, dPCR'nin arka plan gürültüsü daha düşüktür. Naica® damlacık çipli dijital PCR sistemi kullanılarak yapılan testlerde, beklendiği gibi, hasta olmayan örneklerde mutant aleller için pozitif sinyal görülmemiştir.

dPCR sonuçlarıyla karşılaştırıldığında, NGS sonuçlarında neredeyse tüm heterojen örneklerin ikincil alel frekansları abartılı olarak tahmin edilmiştir. NGS deney sürecinde hatalı sekansların girmiş olabileceği ve ikincil alel frekanslarının PCR amplifikasyonu yoluyla değişmiş olabileceği ön varsayımı yapılmaktadır.

NGS'ye kıyasla, dijital PCR daha düşük maliyetli, daha basit kullanımlı, daha sezgisel sonuçlar veren ve düşük frekanslı mutasyon tespiti için daha uygun bir yöntemdir.

Dijital PCR yöntemi, nükleer transplantasyon sonrası mitokondriyal heterojenliğin kantitatif tespiti için uygundur.