Система цифровой ПЦР на основе капельных чипов naica® для высокопроизводительного определения скорости мейотической рекомбинации в ядрах пыльцы ячменя.

2024-05-07

Мейоз поддерживает половое размножение, образуя гаплоидные клетки и обеспечивая генетическое разнообразие на основе гомологичной рекомбинации (ГР). ГР обеспечивает мейотическую сегрегацию хромосом посредством рекомбинантного обмена (КО), синапсиса между гомологичными хромосомами, кроссинговера и т. д., а обеспечение генетического разнообразия играет важную роль в размножении.

У растений гомологичная рекомбинация может быть обнаружена несколькими методами, такими как цитологическое обнаружение посредством анализа мейотических хромосом, генотипирование путем секвенирования и использование молекулярных маркеров или флуоресцентно меченых линий (ФЛ) в расщепляющихся популяциях. ФЛ являются мощным инструментом для измерения событий мейотической рекомбинации в пыльце или семенах арабидопсиса. Однако ФЛ не подходят для сельскохозяйственных культур, поскольку их создание трудоемко и дорого для культур с особенно большими геномами. Кроме того, различные культуры или определенные генотипы не подходят для генетической трансформации. В качестве альтернативы используется генотипирование или секвенирование микроспор (тетрад или ядер пыльцы) для непосредственного обнаружения результатов мейотической рекомбинации в мейотических продуктах. Однако секвенирование/генотипирование микроспор сельскохозяйственных культур довольно дорогостоящее, поэтому количество проводимых тестов ограничено, особенно для видов с большими геномами, таких как злаки.

Измерение скорости мейотической рекомбинации мужских гамет до оплодотворения имеет преимущества большого размера выборки, независимого анализа молекулярных маркеров и немедленного анализа рекомбинационного обмена, но содержание ДНК в гаметах ограничено, а методы секвенирования/генотипирования обычно основаны на амплификации всего генома (WGA). Генотипирование отдельных гамет непосредственно с помощью ПЦР-реакций также невозможно из-за низкого содержания ДНК в гаплоидных гаметах. У ячменя генотипирование отдельных ядер пыльцы завершается путем отделения отдельных гаплоидных ядер пыльцы от внутривидовых гибридов методом флуоресцентной сортировки клеток, за которым следует WGA и многолокусное KASP-генотипирование или секвенирование генома отдельных клеток. ДНК отдельного гаплоидного ядра пыльцы ограничена, а стоимость WGA высока, что приводит к ограниченному количеству анализируемых образцов и невозможности проведения высокопроизводительного анализа.

Ученые из Института генетики растений и исследований сельскохозяйственных культур им. Лейбница в Германии недавно опубликовали в журнале The Plant Journal статью об измерении скорости мейотической рекомбинации. В статье используется система цифровой ПЦР с капельным чипом naica® для измерения скорости мейотической рекомбинации в гаметах, что позволяет проводить высокопроизводительное и недорогое генотипирование.

11rr

Используя генотипический анализ на основе системы цифровой ПЦР с капельным чипом naica®, можно проводить высокопроизводительное измерение частоты мейотической рекомбинации в ядрах пыльцы ячменя без большого количества предварительно выполненной амплификации генетических генов (WGA). После получения пыльцы ядра пыльцы удаляются и очищаются методом проточной цитометрии. Полученные ядра пыльцы добавляются в смесь системы цифровой ПЦР с капельным чипом naica® для обнаружения и определения частоты мейотической рекомбинации. Путем генотипирования более 42 000 отдельных ядер пыльцы (до 4900 ядер на растение) измеряется частота мейотической рекомбинации в пределах двух центромер и двух удаленных хромосомных интервалов у гибридных растений. Частота рекомбинации, определенная в ядре пыльцы, близка к частоте, обнаруженной в расщепляющейся популяции.

26 пр.

▲ Рисунок 1: Схема проведения генотипирования отдельных ядер пыльцы ячменя с использованием системы цифровой ПЦР на чипе naica® Droplet Chip. (a) Пыльники гибридных растений; (b) Пыльца и ядра пыльцы разделяются в суспензии с помощью фильтров с разным размером ячеек (100 и 20 мкм). (c) Ядра пыльцы окрашиваются пропидиум йодидом и сортируются в реакционной смеси для цифровой ПЦР. (d) 25 мкл реакционной смеси для цифровой ПЦР (включая отсортированные ядра пыльцы) загружается в одну из четырех камер сапфирового чипа. (e) Генерация капель и термоциклирование выполняются в Geode. (f) После термоциклирования сапфировый чип сканируется в naica® Prism 3, а анализ данных выполняется в программном обеспечении Crystal Miner.

В данной статье для определения скорости мейотической рекомбинации ядер пыльцы использовался метод двойного зондирования. Например, интервал Id 3-1 между InDel3118 и InDel3135, обнаруженный в ходе предыдущей проверки возможности его использования, был помечен HEX для аллель-специфического зонда Barke (B) (зеленый) и FAM для аллель-специфического зонда Morex (M) (синий) (Рисунок 2b). Исследователи смешивали ядра пыльцы родительских генотипов в соотношении 1:1, а также исследовали ядра пыльцы гибридных растений, гетерозиготных по Id 3-1. В тесте со смешанными родительскими образцами капли двух родительских генотипов были одинаковыми, и оба маркера демонстрировали одинаковую флуоресценцию (HEX для B или FAM для M) (Рисунок 2b). При анализе образцов гибридного материала ожидается появление различных групп капель, представляющих события рекомбинации, то есть капель, одновременно демонстрирующих два цвета (HEX для InDel3118 и FAM для InDel3135, и наоборот) (Рисунок 2b). В ходе фактического анализа было обнаружено, что родительские генотипы получили приблизительно одинаковое количество капель, которые демонстрировали одинаковую флуоресценцию для двух маркеров (Рисунок 2d, e, зеленые и синие прямоугольники). При анализе ядер пыльцы гибридных растений были обнаружены капли двух цветов (HEX и FAM), указывающие на события рекомбинации (Рисунок 2e, красный прямоугольник). Кроме того, можно различить капли, в которых успешно амплифицировался только один маркер (Рисунок 2d, e, кластеры I и iii), и капли без какой-либо амплификации (Рисунок 2d, e, кластер ii). Это показывает, что вполне возможно инкапсулировать и генотипировать отдельные ядра пыльцы с помощью системы цифровой ПЦР на основе капельного чипа naica®.

▲ Рисунок 2. Генотипирование ядер пыльцы ячменя с использованием системы цифровой ПЦР на основе капельного чипа naica®. (a) Маркеры InDel или однонуклеотидные полиморфизмы (SNP), определяющие четыре хромосомных интервала на хромосомах 1 и 3 ячменя. (b) Анализ генотипирования ядер пыльцы на основе системы цифровой ПЦР на основе капельного чипа naica® с использованием Id 3-1 в качестве примера: возможные комбинации двух флуоресцентных зондов позволяют различать рекомбинантные и нерекомбинантные ядра пыльцы. (c) Исходный вид массива активных капель. Каждая камера обычно содержит приблизительно 25 000 стабильных активных капель. Капли, успешно амплифицированные в любом канале (FAM или HEX), обозначены светло-серым цветом, а темно-серые капли — отрицательными. (d, e) Данные генотипирования ядер пыльцы, полученные с помощью системы цифровой ПЦР на чипе naica® Droplet Chip из камер чипа, отображаются в программном обеспечении в виде точечных диаграмм ядер пыльцы родительских генотипов, смешанных в соотношении 1:1 (d), и ядер пыльцы гибридных растений, гетерозиготных по Id 3-1. (e) Были обнаружены две нерекомбинантные родительские популяции в виде капель с успешным генотипированием с помощью двух аллельных зондов, меченных HEX (зеленые прямоугольники) или FAM (синие прямоугольники). На точечной диаграмме смеси родительских генотипов (d) капли, положительные по HEX и FAM, представлены серыми прямоугольниками как ложноположительные результаты + шум. Капли, положительные по HEX и FAM, в гибридных растениях представляют собой рекомбинантные популяции, включающие ложноположительные результаты и шум, показанные красными прямоугольниками (e). Кластеры (I) и (iii) представляют собой капли, в которых успешно амплифицирован только один маркер.

Система цифровой ПЦР на основе капельных чипов naica® обладает чрезвычайно высоким разрешением, поэтому в тех каплях, которые успешно амплифицировали маркер, также можно наблюдать ядра внутри капель (рис. 2c). Исследователи дополнительно оптимизировали эксперимент, проанализировав количество инкапсулированных в капли ядер, и повысили эффективность генотипирования путем предварительной обработки ядер пыльцы термостабильными рестрикционными ферментами. Поскольку количество ядер положительно коррелирует с количеством капель, инкапсулирующих одно ядро, предлагается оптимальный интервал для загрузки ядер (различные ядра разного размера различаются у разных видов).

Представленный в данной работе метод обнаружения на основе двухцветных зондов оказался весьма успешным, а дальнейшее развитие шестицветной платформы позволит одновременно проводить больше групп генотипирования, получать данные множественного генотипирования, а также параллельно измерять скорость рекомбинации более чем одного хромосомного интервала на одной или разных хромосомах или интенсивность/наличие интерференции CO.

В целом, генотипирование отдельных ядер пыльцы ячменя на основе системы цифровой ПЦР с использованием капельного чипа naica® обеспечивает надежные, быстрые и высокоточные измерения мейотической рекомбинации в пределах заданного хромосомного интервала у внутривидовых гибридных растений. Успешная инкапсуляция ядер различных видов с разными размерами ядер и геномов показывает, что предложенный метод широко применим для генотипирования отдельных ядер.

Профессор Стефан Хекманн и доктор Юн-Дже Ан из Института генетики растений и растениеводства им. Лейбница (IPK) в Германии также поделились с нами результатами своих исследований в онлайн-формате. Для более подробного ознакомления с содержанием статьи, пожалуйста, перейдите по ссылке https://mp.weixin.qq.com/s/KNXVs6rOt8MYpBjzuKZZ9A, чтобы посмотреть видео.

Система цифровой ПЦР с использованием шестиканального капельного чипа naica®

Система цифровой ПЦР с использованием шестиканальных капельных чипов naica® от французской компании Stilla Technologies основана на технологии цифровой ПЦР с использованием капельных чипов Crystal. Она автоматизирует генерацию капель и амплификацию. Каждая лунка для образца может обнаруживать 6 флуоресцентных каналов, интеллектуально идентифицировать капли и осуществлять контроль качества. Абсолютная концентрация копий не менее 6 целевых генов может быть получена в течение 3 часов.