Система цифровой ПЦР на основе капельных чипов naica® позволяет точно количественно определять уровни транскрипции R613X в модели нонсенс-мутации гена Scn1a при синдроме Драве.

2024-04-28

Синдром Драве (Dravet) — это тяжелая врожденная генетическая эпилепсия, вызванная мутациями de novo в гене SCN1A. Нонсенс-мутации SCN1A обнаруживаются примерно у 20% пациентов, а мутации SCN1A R613X были выявлены у многих пациентов. Исследователи из Школы нейронаук Сагола, Департамента молекулярной генетики человека и биохимии и Института глазных болезней Гольдшлегера при Тель-Авивском университете (Израиль) опубликовали статью под названием «Вызванные жарой судороги, преждевременная смертность и гиперактивность в новой модели синдрома Драве с нонсенс-мутацией Scn1a» на платформе bioRxiv.

Авторы создали мышиную модель синдрома Драве, содержащую нонсенс-мутацию Scn1a, у которой гетерозиготная мутация Scn1a R613X проявляла спонтанные судороги, восприимчивость к судорогам, вызванным воздействием тепла, и преждевременную смерть, воспроизводя основной фенотип эпилепсии при синдроме Драве. В этом исследовании авторы использовали систему цифровой ПЦР naica® Droplet Chip для аллель-специфического количественного определения мРНК WT Scn1a и R613X.

Основные особенности приложения:

▶ Система цифровой ПЦР на основе капельного чипа naica® позволила точно количественно определить содержание аллелей мРНК WT Scn1a и R613X в мышиной модели Драве.

▶ У гетерозиготных животных система цифровой ПЦР на основе капельного чипа naica® позволила количественно определить стабильный уровень транскрипта R613X на уровне 8,9±0,9% от уровня дикого типа, что указывает на то, что транскрипты мутантного аллеля подвергаются деградации РНК, опосредованной нонсенс-мутациями (NMD), в кортикальной ткани.

Для количественной оценки уровней транскриптов R613X в коре головного мозга использовалась система цифровой ПЦР naica® Droplet Array, позволяющая специфически выявлять ген Scn1a дикого типа и аллель R613X.

Результаты:

Система цифровой ПЦР на микрокапельном чипе naica® не обнаружила аллель R613X в корковых тканях мышей дикого типа, что подтверждает специфичность метода (рисунок A). Аллель дикого типа был обнаружен примерно в половине случаев в тканях Scn1aWT/R613X по сравнению с корой головного мозга мышей дикого типа, как и ожидалось для гетерозиготных животных (рисунок B). У гетерозиготных животных количество стабильных мутантных транскриптов R613X составляло 8,9±0,9% (рисунок C), что значительно ниже ожидаемого уровня в 50%, указывая на то, что транскрипты мутантного аллеля подвергаются сильному нонсенс-опосредованному распаду (NMD) в корковых тканях.

▲Рисунок. Сниженная экспрессия мРНК Scn1a в коре головного мозга мышей Scn1aWT/R613X. A. В ткани коры головного мозга мышей дикого типа не было обнаружено транскриптов аллеля R613X, что демонстрирует специфичность обнаружения этого аллеля. B. В ткани коры головного мозга мышей Scn1aWT/R613X аллель Scn1a дикого типа составлял 48,8% от аллеля в коре головного мозга мышей дикого типа. C. Соотношение аллелей R613X и дикого типа показало, что средний стационарный уровень аллеля Scn1a R613X у животных Scn1aWT/R613X составлял 8,9±0,9% от аллеля дикого типа.

Исходная ссылка: https://doi.org/10.1101/2023.02.01.526678

Система цифровой ПЦР naica® с шестью каналами от компании Stilla Technologies (Франция) основана на технологии цифровой ПЦР с использованием чипов Crystal droplet, которая автоматизирует генерацию капель и амплификацию. Каждая лунка для образца может детектировать 6 флуоресцентных каналов, интеллектуально идентифицировать капли и проводить контроль качества, а также получать абсолютную концентрацию копий не менее 6 целевых генов в течение 3 часов.