Мультиплексная цифровая ПЦР для определения титра количества копий вирусного генома рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV).

【Введение】

Компания Aperbio Xining (Jinghan) Bio объединила усилия для углубленного сотрудничества в области мультиплексного цифрового ПЦР-анализа титра количества копий генома рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV). Эта мощная комбинация использует технологию цифровой ПЦР Naica Crystal (cdPCR) для оптимизации процесса количественного определения количества копий генома рекомбинантных аденоассоциированных вирусов rAAV2 и rAAV8.

【Обзор】

Рекомбинантный аденоассоциированный вирус (рААВ) является ключевым вирусным вектором для генной терапии. Основные проблемы в разработке этого вирусного вектора связаны с оптимизацией процессов на этапах подготовки и обработки, а также стандартизацией схем обнаружения в крупномасштабном производстве. Среди них точное титрование количества копий генома рекомбинантного аденоассоциированного вируса (рААВ) напрямую связано с правильной дозировкой в ​​доклинических и клинических условиях. Разработка стандартного, точного и воспроизводимого метода количественного определения количества копий генома рекомбинантного аденоассоциированного вируса (рААВ) является важной частью разработки и оптимизации процессов в продуктах генной терапии. Сообщается, что использование технологии количественной ПЦР в реальном времени (qPCR) для титрования количества копий генома рекомбинантного аденоассоциированного вируса (рААВ) имеет такие проблемы, как сложная разработка стандартов и низкая количественная воспроизводимость. Технология цифровой ПЦР (dPCR), как новая технология ПЦР, позволяет напрямую количественно определять количество копий генома рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV) без использования стандартов и стандартных кривых. Она обладает высокой устойчивостью к ингибиторам и особенно подходит для количественного определения в неочищенных образцах лизированного вируса.

Рис. 1. Производство рекомбинантного аденоассоциированного вируса (рААВ).

(1) Когда плазмида экспрессионного вектора, фланкированная ITR и несущая последовательность целевого гена, была совместно трансфицирована с

(3) при введении вспомогательной плазмиды аденовируса в клетки HEK-293 эффективность производства вектора AAV была сопоставима с эффективностью при использовании аденовируса для инфицирования.

【Цель эксперимента】

Для оптимизации метода одновременного количественного определения числа копий трех различных генных участков в плазмидном векторе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV) и вирусном геноме мы использовали технологию цифровой ПЦР Naica Crystal (cdPCR): ITR (маркер CY5), EGFP (GOI, маркер HEX) и регуляторный элемент транскрипции WPRE (маркер FAM). При анализе данных были описаны и сравнены условия схем предварительной обработки различных образцов вируса. Было установлено, что линеаризация шпилечной структуры ITR и условия расщепления капсидного белка в схеме предварительной обработки образца вируса особенно важны для точности количественного определения числа копий вирусного генома, что обеспечивает основу для создания стандартного метода обнаружения для цифровой ПЦР в системе контроля качества вирусных векторов генной терапии.

【Схема количественного определения титра копий вирусного генома rAAV】