Узнайте, как выполнить генотипирование KASP с помощью прибора Pangaea qPCR за пять минут.

2024-04-28

Что такое KASP?

KASP (компетентная аллель-специфическая ПЦР) — это новая технология генотипирования, основанная на однонуклеотидных полиморфизмах (SNP). Эта технология основана на считывании флуоресценции после ПЦР-реакции. В каждой лунке используется двухцветная флуоресценция для обнаружения двух возможных генотипов одного образца и одного участка. Это один из наиболее эффективных и экономичных методов генотипирования. Давайте рассмотрим, как проводить генотипирование KASP с помощью прибора Pangu qPCR.

Рабочий процесс KASP

Шаг 1:

Разработайте соответствующие зонды и праймеры. Всего имеется три праймера: два типирующих выше по течению с флуоресцентными коннекторами и один универсальный ниже по течению (рисунок А ниже). Всего имеется четыре зонда: два флуоресцентных зонда и два зонда с гасящим эффектом (рисунок В ниже). Флуоресцентные и гасящие зонды являются комплементарными, а флуоресцентные зонды соответствуют последовательности коннектора (последовательности метки) специфических вышележащих праймеров.

Шаг 2:

Амплификация ПЦР проводится с помощью прибора для количественной ПЦР (qPCR). На первом этапе амплификации ПЦР аллель-специфический праймер (3'-конец может быть парным) идентифицирует специфическую аллельную матрицу и завершает распознавание аллеля. Обратный универсальный праймер также связывается и завершает весь процесс ПЦР. На этом этапе флуоресцентно меченый зонд все еще связан со своим комплементарным гасящим зондом, и флуоресцентный сигнал не генерируется. Начиная со второго этапа амплификации ПЦР, в продукте появляется матрица, несущая универсальную последовательность метки. Этот шаг завершает введение универсальной последовательности метки в продукт ПЦР, соответствующий SNP. Впоследствии к продукту ПЦР добавляется флуоресцентный зонд, связывающийся с ДНК-цепью, комплементарной метке, так что он больше не связывается со своим комплементарным гасящим зондом, тем самым генерируя флуоресцентный сигнал.

Как обеспечить правильное связывание зонда и праймера в процессе ПЦР?

Благодаря установленной программе ПЦР с понижением температуры отжига гарантируется раздельное связывание зонда и праймера. При высокой температуре отжига праймер сначала специфически связывается с матрицей благодаря высокому значению Tm, а затем амплифицируется под действием фермента Taq, увеличивая таким образом количество исходной матрицы для амплификации зонда. По мере снижения температуры отжига зонд начинает связываться с матрицей и затем генерирует флуоресцентный сигнал.

Шаг 3:

После проведения ПЦР-теста Pangu получите данные KASP в меню анализа SNP.

Система ПЦР в реальном времени Pangaea помогает в определении генотипа KASP.

• Скорость нагрева может достигать 8,5 ℃/с, что позволяет быстро проводить 96 реакций генотипирования за один раз и получать результаты с высокой производительностью и хорошей специфичностью.

• Точность контроля температуры ±0,1℃ соответствует строгим требованиям KASP к температуре амплификации, обеспечивая специфичность идентификации различий в отдельных основаниях.

•Поддерживает функцию температурного градиента для 12 колонок, что удобно для быстрой оптимизации условий, необходимых для амплификации KASP.

• Обнаружение вершины оптического волновода, отсутствие краевого эффекта и разности оптических путей, калибровка не требуется.

• 6-канальный детектор цветов, поддерживает различные широко используемые флуоресцентные маркеры и совместим с распространенными наборами для типирования KASP.

Приложение KASP

Технология KASP отличается гибкостью, низкой стоимостью и точностью. По сравнению с другими технологиями, она обладает определенной гибкостью и позволяет легче достигать высокопроизводительного и автоматизированного обнаружения. Кроме того, в KASP используется универсальный зонд, который может применяться в сочетании с различными ген-специфическими праймерами без необходимости синтеза зондов для каждого конкретного участка, что снижает стоимость реагентов в эксперименте. Эта технология широко используется в животноводстве и растениеводстве, идентификации генетических ресурсов, построении генетических карт и определении чистоты семян.