Цифровая ПЦР с использованием капельного чипа naica® позволяет выявлять митохондриальную гетероплазмию после переноса в ядро, получая результаты за 2,5 часа.

Митохондриальные заболевания — это тип генетических расстройств, вызванных генетическими мутациями в митохондриальном геноме (мтДНК), которые передаются только по женской линии. Обычно мутации более чем в 60% митохондриальной ДНК клеток могут привести к заболеваниям, и чем больше мутаций митохондриальной ДНК у человека, тем тяжелее протекает его заболевание.

В настоящее время перенос ядра (ПЯ), также известный как донорство митохондрий, привлекает все больше внимания как стратегия предотвращения передачи митохондриальных заболеваний от больных матерей к потомству. Однако из-за присутствия небольшого количества цитоплазматической мтДНК при трансплантации ядра, что приводит к гетерогенности и амплификации мтДНК у реципиента, необходима точная количественная оценка мутационной нагрузки мтДНК. Ограничениями современных методов секвенирования NGS являются высокая стоимость, длительное время обработки, сложная обработка данных и низкое отношение сигнал/шум.

Наследственная оптическая нейропатия Лебера (LHON) — наиболее распространенное митохондриальное заболевание, передающееся по материнской линии. Группа экспертов из Департамента биологии Гентского университета в Бельгии использовала платформу цифровой ПЦР (dPCR) для обнаружения мутации m.11778 G>A, связанной с LHON, и сравнила ее с методом NGS для изучения применимости цифровой ПЦР в количественной оценке гетерогенности мтДНК. Результаты исследования были опубликованы в известном журнале Clinical Chemistry.

Для оценки применимости dPCR в анализе гетерогенности были подготовлены три типа образцов: (i) 13 образцов от пациентов с высокой мутационной нагрузкой; (ii) три гомогенных образца дикого типа, предоставленных здоровыми добровольцами; (iii) образцы, обработанные NT, несущие низкую мутационную нагрузку из-за остатков мтДНК, всего 6 образцов.

Метод тестирования:

В процессе обработки диапазон мутационной нагрузки образца устанавливается в пределах от 50% до 0,01% для анализа и проверки.

Вывод эксперимента:

Показатели частоты мутаций, наблюдаемые в результатах dPCR и NGS, продемонстрировали хорошую согласованность.

По сравнению с NGS, dPCR имеет более низкий уровень фонового шума. Использование системы цифровой ПЦР на основе капельных чипов Naica® показало отсутствие положительного сигнала для мутантных аллелей в образцах, не содержащих информацию о пациентах, что и ожидалось.

По сравнению с результатами dPCR, частоты вторичных аллелей почти всех гетерогенных образцов были завышены в результатах NGS. Предварительно предполагается, что в процессе эксперимента NGS могли быть внесены некорректные последовательности, и частоты вторичных аллелей были изменены в результате ПЦР-амплификации.

По сравнению с NGS, цифровая ПЦР имеет более низкую стоимость, более простую процедуру выполнения, более интуитивно понятные результаты и лучше подходит для обнаружения мутаций с низкой частотой.

Метод цифровой ПЦР подходит для количественного определения митохондриальной гетерогенности после трансплантации ядра.