PCR digital multiplex para detectar o título do número de cópias do genoma viral do vírus adeno-associado recombinante (rAAV).

【Introdução】

A Aperbio Xining (Jinghan) Bio uniu forças para realizar uma cooperação aprofundada na detecção por PCR digital multiplex do título do número de cópias do genoma viral do vírus adeno-associado recombinante (rAAV). Essa poderosa combinação utiliza a tecnologia de PCR digital Naica Crystal (cdPCR) para otimizar o processo de quantificação do número de cópias do genoma dos vírus adeno-associados recombinantes rAAV2 e rAAV8.

【Visão geral】

O vírus adeno-associado recombinante (rAAV) é um vetor viral fundamental para a terapia gênica. Os principais desafios no desenvolvimento desse vetor viral decorrem da otimização dos processos upstream e downstream e da padronização dos métodos de detecção na produção em larga escala. Dentre eles, a titulação precisa do número de cópias do genoma do rAAV está diretamente relacionada à dosagem correta em ambientes pré-clínicos e clínicos. Estabelecer um método padrão, preciso e reprodutível para quantificar o número de cópias do genoma do rAAV é uma parte importante do desenvolvimento e otimização de processos em produtos de terapia gênica. Relata-se que o uso da tecnologia de PCR quantitativa em tempo real com fluorescência (qPCR) para a detecção por titulação do número de cópias do genoma do rAAV apresenta problemas como a complexidade do estabelecimento de padrões e a baixa repetibilidade quantitativa. A tecnologia de PCR digital (dPCR), como uma nova tecnologia de PCR, permite quantificar diretamente o número de cópias do genoma do rAAV sem depender de padrões e curvas padrão. Possui alta tolerância a inibidores e é particularmente adequado para a detecção quantitativa de amostras de lise viral não purificadas.

Figura 1. Produção de vírus adeno-associado recombinante (rAAV)

(1) Quando o plasmídeo vetor de expressão flanqueado por ITR, contendo a sequência do gene alvo, foi co-transfectado com

(3) o plasmídeo auxiliar do adenovírus em células HEK-293, a eficiência de produção do vetor AAV foi consistente com aquela quando o adenovírus foi usado para infecção.

【Finalidade experimental】

Utilizamos a tecnologia de PCR digital Naica Crystal (cdPCR) para otimizar o método de quantificação simultânea do número de cópias de três diferentes sítios gênicos no vetor plasmídico do vírus adeno-associado recombinante (rAAV) e no genoma viral: ITR (marcador CY5), EGFP (GOI, marcador HEX) e o elemento regulatório relacionado à transcrição WPRE (marcador FAM). Na análise dos dados, as condições dos esquemas de pré-tratamento de diferentes amostras virais foram descritas e comparadas. Constatou-se que a linearização da estrutura em grampo do ITR e as condições de clivagem da proteína do capsídeo no esquema de pré-tratamento da amostra viral foram particularmente importantes para a precisão da quantificação do número de cópias do genoma viral, fornecendo uma base para o estabelecimento de um método de detecção padrão para o método de PCR digital no sistema de controle de qualidade de vetores virais para terapia gênica.

【Esquema de detecção quantitativa para o título do número de cópias do genoma viral rAAV】