naica® 드롭렛 칩 디지털 PCR 시스템을 이용한 보리 꽃가루 핵의 감수분열 재조합률 고처리량 측정

2024년 5월 7일

감수분열은 반수체 세포를 생성하고 상동 재조합(HR)에 기반한 유전적 변이를 통해 유성 생식을 가능하게 합니다. HR은 재조합 교환(CO), 상동 염색체 간의 접합, 교차 등을 통해 감수분열 염색체 분리를 보장하며, 유전적 변이는 번식에 중요한 역할을 합니다.

식물에서 상동 재조합은 감수분열 염색체 분석을 통한 세포학적 검출, 염기서열 분석을 통한 유전자형 분석, 분자 마커 또는 분리 집단 내 형광 표지 라인(FTL)을 이용한 분석 등 여러 가지 기법으로 검출할 수 있습니다. FTL은 애기장대(Arabidopsis)의 꽃가루나 종자에서 감수분열 재조합 현상을 측정하는 데 매우 효과적인 도구입니다. 그러나 FTL은 특히 게놈 크기가 큰 작물의 경우 제작 과정이 복잡하고 비용이 많이 들기 때문에 작물에는 적합하지 않습니다. 또한, 작물 종류나 유전자형에 따라 형질전환이 적합하지 않은 경우도 있습니다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 소포자(사분체 또는 꽃가루 핵)의 유전자형 분석이나 염기서열 분석을 통해 감수분열 산물에서 감수분열 재조합 결과를 직접 검출하는 방법이 사용됩니다. 하지만 작물 소포자의 염기서열 분석/유전자형 분석은 비용이 많이 들기 때문에, 특히 곡물과 같이 게놈 크기가 큰 작물의 경우 검사 횟수에 제한이 있습니다.

수정 전 수컷 배우자의 감수분열 재조합률 측정은 대규모 샘플 확보, 독립적인 분자 마커 분석, 즉각적인 재조합 교환 분석 등의 장점이 있지만, 배우자 DNA 함량이 제한적이고 시퀀싱/유전자형 분석 방법이 일반적으로 전장 유전체 증폭(WGA)에 의존한다는 단점이 있습니다. 또한, 반수체 배우자의 DNA 함량이 매우 낮기 때문에 PCR 반응을 통한 단일 배우자의 직접적인 유전자형 분석은 불가능합니다. 보리의 경우, 단일 꽃가루핵 유전자형 분석은 형광 활성 세포 분류(FACS)를 통해 동종 잡종에서 단일 반수체 꽃가루핵을 분리한 후, WGA 및 다중 유전자좌 KASP 유전자형 분석 또는 단일 세포 유전체 시퀀싱을 통해 수행됩니다. 단일 반수체 꽃가루핵의 DNA 함량이 제한적이고 WGA 비용이 높아 분석 가능한 샘플 수가 제한적이며 대량 분석이 어렵다는 한계가 있습니다.

독일 라이프니츠 식물유전학 및 작물연구소의 과학자들이 최근 식물학 저널(The Plant Journal)에 감수분열 재조합률 측정에 관한 논문을 발표했습니다. 이 논문에서는 naica® 드롭렛 칩 디지털 PCR 시스템을 사용하여 배우자의 감수분열 재조합률을 측정함으로써 고처리량 저비용 유전자형 분석을 구현했습니다.

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naica® 드롭렛칩 디지털 PCR 시스템 기반의 유전자형 분석을 이용하면 대량의 전유전체 증폭(WGA) 없이도 보리 꽃가루 핵의 감수분열 재조합률을 고처리량으로 측정할 수 있다. 꽃가루를 채취한 후, 꽃가루 내 꽃가루 핵을 분리하여 유세포 분석법으로 정제한다. 정제된 꽃가루 핵을 naica® 드롭렛칩 디지털 PCR 시스템의 시료에 첨가하여 감수분열 재조합률을 측정한다. 총 42,000개 이상의 꽃가루 핵(식물체당 최대 4,900개)을 분석하여 잡종 식물체의 두 중심체와 두 개의 멀리 떨어진 염색체 구간 내 감수분열 재조합률을 측정한다. 꽃가루 핵에서 측정된 재조합 빈도는 분리 집단에서 검출된 빈도와 유사하다.

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▲ 그림 1: naica® 드롭렛 칩 디지털 PCR 시스템을 이용한 보리 단일 꽃가루 핵 유전자형 분석 워크플로우. (a) 잡종 식물의 꽃밥; (b) 꽃가루와 꽃가루 핵은 서로 다른 메쉬 크기(100μm 및 20μm)의 필터를 사용하여 현탁액에서 분리된다. (c) 꽃가루 핵은 프로피디움 아이오다이드로 염색하고 유세포 분석기를 이용하여 디지털 PCR 반응 혼합물에 분리한다. (d) 디지털 PCR 반응 혼합물 25μl(분리된 꽃가루 핵 포함)를 사파이어 칩의 네 개의 챔버 중 하나에 주입한다. (e) Geode 소프트웨어에서 드롭렛 생성 및 열 순환을 수행한다. (f) 열 순환 후, 사파이어 칩을 naica® Prism 3에서 스캔하고 Crystal Miner 소프트웨어에서 데이터 분석을 수행한다.

본 연구에서는 이중 프로브 방법을 이용하여 꽃가루 핵의 감수분열 재조합률을 검출하였다. 예를 들어, 이전 타당성 검증에서 검출된 InDel3118과 InDel3135 사이의 Id 3-1 구간은 Barke(B) 대립유전자 특이적 프로브(녹색)에는 HEX, Morex(M) 대립유전자 특이적 프로브(파란색)에는 FAM으로 표지하였다(그림 2b). 연구진은 부모 계통의 꽃가루 핵을 1:1 비율로 혼합하고, Id 3-1에 대해 이형접합체인 잡종 식물의 꽃가루 핵도 검출하였다. 부모 계통 혼합 시료 시험에서 두 부모 계통의 꽃가루 핵의 양이 동일하였고, 두 마커는 동일한 형광(B는 HEX, M은 FAM)을 나타냈다(그림 2b). 잡종 물질 시료 검출 시, 재조합 현상을 나타내는 서로 다른 액적 그룹, 즉 두 가지 색상을 동시에 나타내는 액적(InDel3118의 경우 HEX, InDel3135의 경우 FAM, 또는 그 반대의 경우)이 나타날 것으로 예상됩니다(그림 2b). 실제 검출 결과, 부모 유전자형에서 두 마커에 대해 동일한 형광을 나타내는 액적의 수가 거의 동일한 것으로 나타났습니다(그림 2d, e, 녹색 및 파란색 사각형). 잡종 식물의 꽃가루 핵 검출에서는 재조합 현상을 나타내는 두 가지 색상(HEX 및 FAM)의 액적이 검출되었습니다(그림 2e, 빨간색 사각형). 또한, 하나의 마커만 성공적으로 증폭된 액적(그림 2d, e, 클러스터 I 및 iii)과 어떤 마커도 증폭되지 않은 액적(그림 2d, e, 클러스터 ii)을 구분할 수 있었습니다. 이는 naica® 드롭렛 칩 디지털 PCR 시스템을 사용하여 단일 꽃가루 핵을 캡슐화하고 유전자형을 분석하는 것이 완전히 가능하다는 것을 보여줍니다.

▲ 그림 2. naica® 드롭렛 칩 디지털 PCR 시스템을 이용한 보리 꽃가루 핵의 유전자형 분석. (a) 보리 염색체 1번과 3번의 네 개의 염색체 구간을 정의하는 삽입/결실(InDel) 또는 단일 염기 다형성(SNP) 마커. (b) Id 3-1을 예로 들어 naica® 드롭렛 칩 디지털 PCR 시스템을 기반으로 한 꽃가루 핵의 유전자형 분석: 두 개의 형광 프로브의 가능한 조합을 통해 재조합 꽃가루 핵과 비재조합 꽃가루 핵을 구별할 수 있다. (c) 활성 드롭렛 어레이의 원본 모습. 각 챔버에는 일반적으로 약 25,000개의 안정적인 활성 드롭렛이 포함되어 있다. 어떤 채널(FAM 또는 HEX)에서든 증폭에 성공한 드롭렛은 밝은 회색이고, 어두운 회색 드롭렛은 음성이다. (d, e) naica® Droplet Chip Digital PCR 시스템을 기반으로 칩 챔버에서 얻은 꽃가루 핵의 유전자형 분석 데이터는 소프트웨어에서 도트 플롯으로 표시됩니다. 이는 1:1 비율로 혼합된 부모 유전자형의 꽃가루 핵(d)과 Id 3-1에 대해 이형접합체인 잡종 식물의 꽃가루 핵(e)을 나타냅니다. 두 개의 비재조합 부모 집단은 두 개의 HEX 표지(녹색 상자) 또는 FAM 표지 대립유전자 프로브(파란색 상자)를 사용하여 유전자형 분석에 성공한 드롭릿으로 검출되었습니다. 부모 유전자형 혼합물의 도트 플롯(d)에서 HEX 및 FAM 이중 양성 드롭릿은 회색 상자로 표시되며, 이는 위양성 + 노이즈를 나타냅니다. 잡종 식물에서 HEX 및 FAM 이중 양성 드롭릿은 위양성 및 노이즈를 포함하는 재조합 집단이며, 빨간색 상자로 표시됩니다(e). 클러스터 (I) 및 (iii)은 하나의 마커만 성공적으로 증폭된 드롭릿을 나타냅니다.

naica® 드롭릿 칩 디지털 PCR 시스템은 매우 높은 해상도를 가지고 있어 마커 증폭에 성공한 드롭릿에서는 드롭릿 내부의 핵까지 관찰할 수 있습니다(그림 2c). 연구진은 드롭릿에 캡슐화된 핵의 수를 분석하여 실험을 더욱 최적화하고, 내열성 제한 효소로 꽃가루 핵을 전처리하여 유전자형 분석 효율을 향상시켰습니다. 핵의 수는 하나의 핵을 캡슐화하는 드롭릿의 수와 양의 상관관계를 가지므로, 핵을 로딩하기에 최적의 간격을 제안했습니다(종에 따라 크기가 다른 핵의 수는 다릅니다).

본 논문에서 제시된 2색 프로브 기반 검출은 매우 성공적이며, 6색 플랫폼을 통해 더 많은 유전자형 검출 그룹을 동시에 수행하고, 다중 유전자형 데이터를 얻을 수 있으며, 동일하거나 다른 염색체에서 둘 이상의 염색체 구간의 재조합률을 병렬적으로 측정하거나, CO 간섭의 강도/존재 여부를 측정할 수 있다.

일반적으로, 나이카® 드롭릿 칩 디지털 PCR 시스템을 기반으로 한 보리 꽃가루 단일 핵의 유전자형 분석은 동종 잡종 식물의 특정 염색체 구간 내에서 신뢰할 수 있고 신속하며 높은 정밀도의 감수분열 재조합 측정을 제공합니다. 핵 크기와 게놈 크기가 다른 다양한 종의 핵을 성공적으로 캡슐화한 결과는 제안된 방법이 단일 핵의 유전자형 분석에 광범위하게 적용될 수 있음을 보여줍니다.

독일 라이프니츠 식물유전학·작물과학연구소(IPK)의 슈테판 헤크만 교수와 안윤재 박사께서도 온라인으로 연구 결과를 공유해 주셨습니다. 이 기사의 자세한 내용을 직관적으로 이해하고 싶으시다면, https://mp.weixin.qq.com/s/KNXVs6rOt8MYpBjzuKZZ9A 링크를 클릭하여 영상을 시청해 주세요.

naica® 6채널 드롭렛 칩 디지털 PCR 시스템

프랑스 Stilla Technologies의 naica® 6채널 드롭렛 칩 디지털 PCR 시스템은 Crystal 드롭렛 칩 디지털 PCR 기술을 기반으로 합니다. 이 시스템은 드롭렛 생성 및 증폭 과정을 자동화합니다. 각 샘플 웰은 6개의 형광 채널을 감지하고, 드롭렛을 지능적으로 식별하며, 품질 관리를 수행할 수 있습니다. 최소 6개 표적 유전자의 절대 복제 수 농도를 3시간 이내에 얻을 수 있습니다.