재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 바이러스 유전체 복제 수의 역가를 검출하기 위한 멀티플렉스 디지털 PCR

【소개】

아페르비오 시닝(징한) 바이오는 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 바이러스 유전체 복제 수의 역가를 측정하는 다중 디지털 PCR 검출 분야에서 심층적인 협력을 진행하기 위해 손을 잡았습니다. 이 강력한 협력은 나이카 크리스탈 디지털 PCR 기술(cdPCR)을 활용하여 재조합 아데노 관련 바이러스 rAAV2 및 rAAV8의 유전체 복제 수 정량화 과정을 최적화합니다.

【개요】

재조합 아데노연관바이러스(rAAV)는 유전자 치료에 있어 핵심적인 바이러스 벡터입니다. 이 바이러스 벡터 개발의 주요 과제는 대규모 생산에서 상류 및 하류 공정 최적화와 검출 방식의 표준화에 있습니다. 그중에서도 재조합 아데노연관바이러스(rAAV) 게놈 복제 수의 정확한 정량은 전임상 및 임상 환경에서 적정 용량과 직접적인 관련이 있습니다. 재조합 아데노연관바이러스(rAAV) 게놈 복제 수를 정량하는 표준적이고 정확하며 재현 가능한 방법을 확립하는 것은 유전자 치료제 제품의 공정 개발 및 최적화에 있어 중요한 부분입니다. 실시간 형광 정량 PCR(qPCR) 기술을 이용한 재조합 아데노연관바이러스(rAAV) 게놈 복제 수 정량 검출은 표준 확립의 복잡성과 낮은 정량적 재현성 등의 문제점을 가지고 있는 것으로 보고되었습니다. 새로운 PCR 기술인 디지털 PCR(dPCR) 기술은 표준물질이나 표준곡선에 의존하지 않고 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 게놈 복제 수를 직접 정량화할 수 있습니다. 또한 저해제에 대한 내성이 뛰어나 정제되지 않은 바이러스 용해 시료의 정량적 검출에 특히 적합합니다.

그림 1. 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 생산

(1) 표적 유전자 서열을 포함하는 ITR로 둘러싸인 발현 벡터 플라스미드를 다음과 함께 공동 형질전환했을 때

(3) 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드를 HEK-293 세포에 주입했을 때, AAV 벡터의 생산 효율은 아데노바이러스를 감염에 사용했을 때와 동일했습니다.

【실험 목적】

본 연구에서는 Naica Crystal 디지털 PCR 기술(cdPCR)을 이용하여 재조합 아데노연관바이러스(rAAV) 플라스미드 벡터 및 바이러스 게놈 내 세 가지 유전자 부위(ITR(CY5 마커), EGFP(GOI, HEX 마커), 전사 관련 조절 요소 WPRE(FAM 마커))의 동시 복제 수 정량 분석을 위한 최적의 방법을 개발하였다. 데이터 분석에서는 다양한 바이러스 시료의 전처리 조건을 분석하고 비교하였다. 그 결과, 바이러스 시료 전처리 과정에서 ITR 헤어핀 구조의 선형화와 캡시드 단백질의 절단 조건이 바이러스 게놈 복제 수 정량 분석의 정확도에 특히 중요한 영향을 미치는 것으로 나타났다. 이는 유전자 치료용 바이러스 벡터의 품질 관리 시스템에서 디지털 PCR 방법의 표준 검출법을 확립하는 데 기초가 된다.

【rAAV 바이러스 유전체 복제 수 역가 정량 검출 방법】