naica® ドロップレットチップデジタルPCRシステム：オオムギ花粉核における減数分裂組換え率の高スループット測定

2024年5月7日

減数分裂は、相同組換え（HR）に基づく半数体細胞と遺伝的多様性を生み出すことで、有性生殖を支えています。HRは、相同染色体間のシナプス形成や交叉などによる組換え交換（CO）を通じて減数分裂時の染色体分離を確実にし、遺伝的多様性が育種において重要な役割を果たすことを保証します。

植物では、相同組換えは、減数分裂染色体分析による細胞学的検出、配列決定による遺伝子型判定、分離集団における分子マーカーまたは蛍光標識系統（FTL）など、いくつかの手法で検出できます。FTLは、シロイヌナズナの花粉や種子における減数分裂組換え事象を測定するための強力なツールです。しかし、FTLは、特にゲノムサイズの大きい作物ではFTLを作成するのに手間と費用がかかるため、作物には適していません。さらに、作物の種類や特定の遺伝子型によっては、遺伝子形質転換に適さないものもあります。代替手段として、減数分裂産物における減数分裂組換えの結果を直接検出するために、小胞子（四分子または花粉核）の遺伝子型判定または配列決定が用いられます。しかし、作物の小胞子の配列決定/遺伝子型判定は非常に高価であるため、特に穀物などのゲノムサイズの大きい種では、実施できる検査の数が限られています。

受精前に雄性配偶子の減数分裂組換え率を測定することは、サンプルサイズが大きい、独立した分子マーカー分析、および即時組換え交換分析という利点があるが、配偶子DNA含有量が限られているため、シーケンス/ジェノタイピング法は通常、全ゲノム増幅（WGA）に依存している。半数体配偶子のDNA含有量が少ないため、PCR反応による単一配偶子の直接ジェノタイピングも不可能である。オオムギでは、蛍光活性化セルソーティングによって種内雑種から単一の半数体花粉核を分離し、その後WGAおよびマルチローカスKASPジェノタイピングまたは単一細胞ゲノムシーケンスを行うことで、単一花粉核のジェノタイピングが完了する。単一の半数体花粉核のDNAは限られており、WGAのコストが高いため、分析できるサンプル数が限られ、ハイスループット分析を完了することができない。

ドイツのライプニッツ植物遺伝学・作物植物研究所の研究者らは、最近、減数分裂組換え率の測定に関する論文を『The Plant Journal』誌に発表した。この論文では、naica®ドロップレットチップデジタルPCRシステムを用いて配偶子の減数分裂組換え率を測定し、ハイスループットかつ低コストの遺伝子型判定を実現している。

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naica®ドロップレットチップデジタルPCRシステムに基づく遺伝子型解析を用いることで、大量のWGAを事前に実施することなく、オオムギ花粉核における減数分裂組換え率のハイスループット測定が可能となる。花粉を採取後、花粉中の花粉核をフローサイトメトリーで分離・精製する。得られた花粉核をnaica®ドロップレットチップデジタルPCRシステムのミックスに加え、検出することで減数分裂組換え率を測定する。合計42,000個以上の花粉核（1株あたり最大4,900個）を遺伝子型解析することで、雑種植物における2つのセントロメアと2つの離れた染色体領域内の減数分裂組換え率を測定する。花粉核で測定した組換え頻度は、分離集団で検出された頻度とほぼ一致する。

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▲ 図 1: naica® Droplet Chip デジタル PCR システムを使用したオオムギの単一花粉核遺伝子型判定のワークフロー。(a) ハイブリッド植物の葯。(b) 異なるメッシュサイズ (100 μm と 20 μm) のフィルターを使用して、懸濁液中で花粉と花粉核を分離します。(c) 花粉核をヨウ化プロピジウムで染色し、フローソーティングによりデジタル PCR 反応ミックスに分離します。(d) 25 μl のデジタル PCR 反応ミックス (分離した花粉核を含む) をサファイアチップの 4 つのチャンバーの 1 つにロードします。(e) Geode でドロップレット生成とサーマルサイクリングを実行します。(f) サーマルサイクリング後、サファイアチップを naica® Prism 3 でスキャンし、Crystal Miner ソフトウェアでデータ解析を実行します。

この論文では、花粉核の減数分裂組換え率を検出するためにデュアルプローブ法が用いられた。例えば、以前の実現可能性検証で検出されたInDel3118とInDel3135の間の区間Id 3-1は、Barke（B）アレル特異的プローブ（緑色）にはHEX、Morex（M）アレル特異的プローブ（青色）にはFAMで標識された（図2b）。研究者らは、親遺伝子型の花粉核を1：1の比率で混合し、Id 3-1に関してヘテロ接合性の雑種植物の花粉核も検出した。親混合サンプル試験では、2つの親遺伝子型の液滴は等しく、2つのマーカーは同じ蛍光（Bの場合はHEX、Mの場合はFAM）を示した（図2b）。ハイブリッド材料サンプルの検出では、組換えイベントを表す異なる液滴グループ、すなわち、同時に 2 色を示す液滴 (InDel3118 の場合は HEX、InDel3135 の場合は FAM、その逆) が現れることが予想されます (図 2b)。実際の検出では、親遺伝子型は、2 つのマーカーに対して同じ蛍光を示す液滴をほぼ同数得ることがわかりました (図 2d、e、緑と青の四角)。ハイブリッド植物の花粉核の検出では、組換えイベントを示す 2 色 (HEX と FAM) の液滴が検出されました (図 2e、赤の四角)。さらに、1 つのマーカーのみが正常に増幅された液滴 (図 2d、e、クラスター I と iii) と、増幅されていない液滴 (図 2d、e、クラスター ii) を区別できます。これは、naica®ドロップレットチップデジタルPCRシステムを用いて、単一の花粉核をカプセル化して遺伝子型を決定することが完全に可能であることを示している。

▲ 図 2. naica® Droplet Chip デジタル PCR システムを使用したオオムギ花粉核の遺伝子型判定。(a) オオムギ染色体 1 番と 3 番の 4 つの染色体区間を定義する InDel または一塩基多型 (SNP) マーカー。(b) Id 3-1 を例として、naica® Droplet Chip デジタル PCR システムに基づく花粉核の遺伝子型判定分析: 2 つの蛍光プローブの可能な組み合わせにより、組換え花粉核と非組換え花粉核を区別できます。(c) 活性液滴アレイの生データ。各チャンバーには通常、約 25,000 個の安定した活性液滴が含まれています。いずれかのチャネル (FAM または HEX) で正常に増幅された液滴は薄い灰色で、濃い灰色の液滴は陰性です。（d、e）チップチャンバーから得られたnaica® Droplet Chip Digital PCRシステムに基づく花粉核の遺伝子型決定データは、1:1の比率で混合された親遺伝子型の花粉核（d）と、Id 3-1とヘテロ接合性のハイブリッド植物の花粉核のドットプロットとしてソフトウェアに表示される。（e）2つの非組換え親集団は、2つのHEX標識（緑色のボックス）またはFAM標識アレルプローブ（青色のボックス）による遺伝子型決定が成功したドロップレットとして検出された。親遺伝子型混合物のドットプロット（d）では、HEXとFAMの両方が陽性のドロップレットは、偽陽性＋ノイズとして灰色のボックスで表されている。ハイブリッド植物のHEXとFAMの両方が陽性のドロップレットは、偽陽性とノイズを含む組換え集団であり、赤色のボックスで示されている（e）。クラスター（I）と（iii）は、1つのマーカーのみが正常に増幅されたドロップレットを表す。

naica® Droplet Chip Digital PCR Systemは非常に高解像度であるため、マーカーの増幅に成功した液滴では、液滴内の核も観察できます（図2c）。研究者らは、液滴に封入された核の数を分析することで実験をさらに最適化し、耐熱性制限酵素で花粉核を前処理することで遺伝子型判定の効率を向上させました。核の数は、1つの核を封入する液滴の数と正の相関があるため、核をロードする最適な間隔が提案されています（異なるサイズの核は種によって異なります）。

本論文で紹介した2色プローブに基づく検出は非常に成功しており、さらに6色プラットフォームを用いることで、より多くの遺伝子型判定を同時に実施し、複数の遺伝子型判定データを取得し、同一または異なる染色体上の複数の染色体領域の組換え率を並行して測定したり、CO干渉の強度や存在を測定したりすることが可能になります。

一般的に、naica®ドロップレットチップデジタルPCRシステムを用いたオオムギ花粉核の遺伝子型判定は、種内雑種植物の特定の染色体領域内における減数分裂組換えを、信頼性が高く、迅速かつ高精度に測定することを可能にする。核の大きさやゲノムサイズが異なる様々な種の核をカプセル化することに成功したことから、本手法は単一核の遺伝子型判定に幅広く適用可能であることが示された。

ドイツのライプニッツ植物遺伝学・作物科学研究所（IPK）のシュテファン・ヘックマン教授とユンジェ・アン博士も、オンラインで研究成果を共有してくださいました。この記事の詳細を直感的に理解したい方は、https://mp.weixin.qq.com/s/KNXVs6rOt8MYpBjzuKZZ9A をクリックして動画をご覧ください。

naica® 6チャンネル液滴チップデジタルPCRシステム

フランスのStilla Technologies社製naica® 6チャンネル液滴チップデジタルPCRシステムは、Crystal液滴チップデジタルPCR技術をベースとしています。液滴の生成と増幅を自動化し、各サンプルウェルで6つの蛍光チャンネルを検出し、液滴をインテリジェントに識別して品質管理を行うことができます。少なくとも6つの標的遺伝子の絶対コピー数濃度を3時間以内に取得可能です。