組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）のウイルスゲノムコピー数を検出するためのマルチプレックスデジタルPCR

【導入】

Aperbio Xining (Jinghan) Bioは、組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）のウイルスゲノムコピー数の力価をマルチプレックスデジタルPCRで検出するための包括的な協力体制を構築しました。この強力な組み合わせは、Naica CrystalデジタルPCR技術（cdPCR）を用いて、組換えアデノ随伴ウイルスrAAV2およびrAAV8のゲノムコピー数定量化プロセスを最適化します。

【概要】

組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）は、遺伝子治療における重要なウイルスベクターです。このウイルスベクターの開発における主な課題は、上流および下流工程の最適化と、大規模生産における検出スキームの標準化にあります。中でも、組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ゲノムコピー数の正確な滴定は、前臨床および臨床環境における適切な投与量に直接関係します。組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ゲノムコピー数を定量するための標準的で正確かつ再現性のある方法を確立することは、遺伝子治療製品のプロセス開発と最適化の重要な部分です。組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ゲノムコピー数の滴定検出にリアルタイム蛍光定量PCR（qPCR）技術を使用すると、標準の設定が複雑で定量再現性が低いなどの問題が発生することが報告されています。新しいPCR技術であるデジタルPCR（dPCR）技術は、標準や標準曲線に頼ることなく、組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ゲノムコピー数を直接定量できます。阻害物質に対する耐性が高く、未精製のウイルス溶解サンプルの定量的検出に特に適している。

図1．組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）の生産

（１）標的遺伝子配列を含むITRで挟まれた発現ベクタープラスミドを共トランスフェクションすると、

（３）アデノウイルスヘルパープラスミドをHEK-293細胞に導入したところ、AAVベクターの生産効率はアデノウイルス感染時と同等であった。

【実験目的】

我々は、Naica CrystalデジタルPCR技術（cdPCR）を用いて、組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）プラスミドベクターおよびウイルスゲノム中の3つの異なる遺伝子部位（ITR（CY5マーカー）、EGFP（GOI、HEXマーカー）、転写関連調節エレメントWPRE（FAMマーカー））のコピー数を同時に定量する方法を最適化した。データ解析では、異なるウイルスサンプルの前処理スキームの条件を記述し、比較した。その結果、ウイルスサンプルの前処理スキームにおけるITRヘアピン構造の線状化とカプシドタンパク質の切断条件が、ウイルスゲノムコピー数の定量精度に特に重要であることが分かり、遺伝子治療用ウイルスベクターの品質管理システムにおけるデジタルPCR法の標準検出方法を確立するための基礎となった。

【rAAVウイルスゲノムコピー数力価の定量的検出法】