Pangaea qPCR装置を用いたKASP遺伝子型判定テストの実施方法を5分で学びましょう。

2024年4月28日

KASPとは何ですか？

KASP（kompetitive allele specific PCR）は、一塩基多型（SNP）に基づく新しい遺伝子型判定技術です。この技術は、PCR反応後の蛍光検出に基づいています。各ウェルは2色の蛍光を用いて、1つのサンプルと1つの部位における2つの遺伝子型を検出します。これは、最も効率的かつ経済的な遺伝子型判定方法の1つです。Pangu qPCR装置を用いたKASP遺伝子型判定の実施方法を見ていきましょう。

KASPワークフロー

ステップ1：

対応するプローブとプライマーを設計します。プライマーは全部で3種類あり、蛍光コネクター付きの上流タイピングプライマーが2種類、下流ユニバーサルプライマーが1種類です（下図A）。プローブは全部で4種類あり、蛍光プローブが2種類、クエンチングプローブが2種類です（下図B）。蛍光プローブとクエンチングプローブは相補的であり、蛍光プローブは特定の上流プライマーのコネクター配列（タグ配列）と一致します。

ステップ2：

PCR増幅はqPCR装置を用いて行われます。最初のPCR増幅では、アレル特異的プライマー（3'末端は対合可能）が特定のアレルテンプレートを識別し、アレル認識を完了します。逆方向のユニバーサルプライマーも結合し、PCRプロセス全体を完了します。この段階では、蛍光標識プローブはまだ相補的なクエンチングプローブに結合しており、蛍光シグナルは発生しません。2回目のPCR増幅から、ユニバーサルタグ配列を持つテンプレートが産物中に現れます。このステップにより、SNPに対応するPCR産物へのユニバーサルタグ配列の導入が完了します。続いて、蛍光プローブがタグに相補的なDNA鎖に結合することでPCR産物に付加され、相補的なクエンチングプローブとの結合が解除され、蛍光シグナルが発生します。

PCRプロセス中にプローブとプライマーが期待どおりに結合することを確実にするにはどうすればよいでしょうか？

タッチダウンPCRプログラムが設定されているため、プローブとプライマーの分離結合が保証されます。アニーリング温度が高い場合、プライマーは高いTm値のため、まずテンプレートに特異的に結合し、その後Taq酵素の作用によって増幅され、プローブ増幅のための元のテンプレートが増加します。アニーリング温度が低下すると、プローブがテンプレートに結合し始め、蛍光シグナルを生成します。

ステップ3：

Pangu qPCR検査を実行した後、SNP解析メニューからKASPデータを取得してください。

PangaeaリアルタイムPCRシステムがKASP遺伝子型判定の検出を支援

加熱速度は最大8.5℃/秒に達し、96個の遺伝子型判定反応を一度に迅速に完了させ、結果を出力できます。高い製品収率と優れた特異性を備えています。

・±0.1℃の温度制御精度は、増幅温度に関するKASPの厳しい要件を満たしており、単一塩基の違いを識別する特異性を保証します。

・12列の温度勾配機能をサポートしており、KASP増幅に必要な条件を迅速に最適化するのに便利です。

・光導波路上面検出方式、エッジ効果や光路差なし、キャリブレーション不要

・6色検出チャンネルを搭載し、一般的に使用される様々な蛍光マーカーに対応、また、一般的に使用されるKASPタイピングキットと互換性があります。

KASPアプリケーション

KASP技術は、柔軟性、低コスト、そして高精度を特長としています。他の技術と比較して、一定の柔軟性を持ち、ハイスループットかつ自動的な検出を容易に実現できます。さらに、KASPは汎用プローブを使用するため、様々な遺伝子特異的プライマーと組み合わせて使用でき、各部位ごとにプローブを合成する必要がなく、実験における試薬コストを削減できます。この技術は、動物や植物の育種、遺伝資源の同定、遺伝子地図の構築、種子の純度判定といった分野で幅広く活用されています。