Sistema di estrazione degli acidi nucleici qMate Mini
Scienze della vita
Sistema naica® Droplet Chip Digital PCR per la determinazione ad alta produttività del tasso di ricombinazione meiotica nei nuclei del polline d'orzo
2024-05-07
La meiosi supporta la riproduzione sessuale producendo cellule aploidi e variabilità genetica basata sulla ricombinazione omologa (HR). L'HR garantisce la segregazione cromosomica meiotica attraverso lo scambio ricombinante (CO), la sinapsi tra cromosomi omologhi, il crossing-over, ecc., assicurando al contempo che la variabilità genetica svolga un ruolo nella riproduzione.
Nelle piante, la ricombinazione omologa può essere rilevata con diverse tecniche, come l'individuazione citologica tramite analisi dei cromosomi meiotici, la genotipizzazione mediante sequenziamento e marcatori molecolari o linee fluorescenti (FTL) in popolazioni segreganti. Le FTL sono uno strumento efficace per misurare gli eventi di ricombinazione meiotica nel polline o nei semi di Arabidopsis. Tuttavia, le FTL non sono adatte alle colture perché la loro generazione è laboriosa e costosa in colture con genomi particolarmente grandi. Inoltre, alcune colture o determinati genotipi non sono adatti alla trasformazione genetica. In alternativa, si utilizza la genotipizzazione o il sequenziamento delle microspore (tetradi o nuclei pollinici) per rilevare direttamente i risultati della ricombinazione meiotica nei prodotti meiotici. Tuttavia, il sequenziamento/genotipizzazione delle microspore delle colture è piuttosto costoso, quindi il numero di test che possono essere eseguiti è limitato, soprattutto per specie con genomi di grandi dimensioni come i cereali.
La misurazione del tasso di ricombinazione meiotica dei gameti maschili prima della fecondazione presenta i vantaggi di un ampio campione, dell'analisi indipendente dei marcatori molecolari e dell'analisi immediata dello scambio di ricombinazione, ma il contenuto di DNA dei gameti è limitato e i metodi di sequenziamento/genotipizzazione si basano solitamente sull'amplificazione dell'intero genoma (WGA). Anche la genotipizzazione di singoli gameti direttamente tramite reazioni PCR è impossibile a causa del basso contenuto di DNA dei gameti aploidi. Nell'orzo, la genotipizzazione di singoli nuclei pollinici viene effettuata separando i singoli nuclei pollinici aploidi dagli ibridi intraspecifici mediante citometria a flusso, seguita da WGA e genotipizzazione multilocus KASP o sequenziamento del genoma di singole cellule. Il DNA di un singolo nucleo pollinico aploide è limitato e il costo della WGA è elevato, il che si traduce in un numero limitato di campioni analizzati e nell'impossibilità di completare analisi ad alto rendimento.
Alcuni scienziati del Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research in Germania hanno recentemente pubblicato un articolo sulla misurazione del tasso di ricombinazione meiotica sulla rivista The Plant Journal. L'articolo utilizza il sistema di PCR digitale a chip naica® droplet per misurare il tasso di ricombinazione meiotica nei gameti, consentendo una genotipizzazione ad alta produttività e a basso costo.
Utilizzando l'analisi di genotipizzazione basata sul sistema di PCR digitale a chip a goccia naica®, è possibile effettuare misurazioni ad alta produttività dei tassi di ricombinazione meiotica nei nuclei del polline d'orzo senza la necessità di una grande quantità di WGA pre-eseguita. Dopo aver ottenuto il polline, i nuclei pollinici vengono rimossi e purificati mediante citometria a flusso. I nuclei pollinici ottenuti vengono aggiunti al Mix del sistema di PCR digitale a chip a goccia naica® per l'analisi e la determinazione del tasso di ricombinazione meiotica. Genotipizzando un totale di oltre 42.000 singoli nuclei pollinici (fino a 4900 nuclei per pianta), è possibile misurare i tassi di ricombinazione meiotica all'interno di due centromeri e due intervalli cromosomici distanti nelle piante ibride. La frequenza di ricombinazione determinata nel nucleo pollinico è vicina alla frequenza rilevata nella popolazione segregante.
▲ Figura 1: Flusso di lavoro per la genotipizzazione di singoli nuclei pollinici di orzo utilizzando il sistema naica® Droplet Chip Digital PCR. (a) Antere di piante ibride; (b) Polline e nuclei pollinici vengono separati in sospensione utilizzando filtri con diverse dimensioni di maglia (100 e 20 μm). (c) I nuclei pollinici vengono colorati con ioduro di propidio e separati mediante citometria a flusso nella miscela di reazione per PCR digitale. (d) 25 μl di miscela di reazione per PCR digitale (inclusi i nuclei pollinici separati) vengono caricati in una delle quattro camere del chip di zaffiro. (e) La generazione di gocce e il ciclo termico vengono eseguiti in Geode. (f) Dopo il ciclo termico, il chip di zaffiro è stato scansionato in naica® Prism 3 e l'analisi dei dati è stata eseguita nel software Crystal Miner.
Questo articolo ha utilizzato un metodo a doppia sonda per rilevare il tasso di ricombinazione meiotica dei nuclei pollinici. Ad esempio, l'intervallo Id 3-1 tra InDel3118 e InDel3135 rilevato nella precedente verifica di fattibilità è stato etichettato con HEX per la sonda allele-specifica Barke (B) (verde) e con FAM per la sonda allele-specifica Morex (M) (blu) (Figura 2b). I ricercatori hanno miscelato nuclei pollinici provenienti da genotipi parentali in un rapporto 1:1 e hanno anche rilevato nuclei pollinici provenienti da piante ibride eterozigoti per Id 3-1. Nel test del campione misto parentale, le gocce dei due genotipi parentali erano uguali e i due marcatori mostravano la stessa fluorescenza (HEX per B o FAM per M) (Figura 2b). Nell'analisi di campioni di materiale ibrido, ci si aspetta la comparsa di diversi gruppi di goccioline che rappresentano eventi di ricombinazione, ovvero goccioline che mostrano due colori contemporaneamente (HEX per InDel3118 e FAM per InDel3135, e viceversa) (Figura 2b). Nell'analisi effettiva, si è osservato che i genotipi parentali presentavano un numero approssimativamente uguale di goccioline che mostravano la stessa fluorescenza per i due marcatori (Figura 2d, e, rettangoli verdi e blu). Nell'analisi dei nuclei pollinici delle piante ibride, sono state rilevate goccioline con due colori (HEX e FAM), indicative di eventi di ricombinazione (Figura 2e, rettangolo rosso). Inoltre, è possibile distinguere le goccioline in cui è stato amplificato con successo un solo marcatore (Figura 2d, e, cluster I e iii) dalle goccioline senza alcuna amplificazione (Figura 2d, e, cluster ii). Ciò dimostra che è assolutamente fattibile incapsulare e genotipizzare singoli nuclei di polline utilizzando il sistema di PCR digitale a chip a gocce naica®.
▲ Figura 2. Genotipizzazione dei nuclei del polline d'orzo utilizzando il sistema naica® Droplet Chip Digital PCR. (a) Marcatori InDel o polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) che definiscono quattro intervalli cromosomici sui cromosomi 1 e 3 dell'orzo. (b) Analisi di genotipizzazione dei nuclei del polline basata sul sistema naica® Droplet Chip Digital PCR utilizzando Id 3-1 come esempio: possibili combinazioni di due sonde fluorescenti consentono di distinguere tra nuclei del polline ricombinanti e non ricombinanti. (c) Vista grezza della matrice di goccioline attive. Ogni camera contiene in genere circa 25.000 goccioline attive stabili. Le goccioline che sono state amplificate con successo in qualsiasi canale (FAM o HEX) sono di colore grigio chiaro, mentre le goccioline grigio scuro sono negative. (d, e) I dati di genotipizzazione dei nuclei pollinici basati sul sistema naica® Droplet Chip Digital PCR dalle camere del chip sono visualizzati nel software come grafici a punti di nuclei pollinici di genotipi parentali miscelati in un rapporto 1:1 (d) e nuclei pollinici di piante ibride eterozigoti con Id 3-1. (e) Due popolazioni parentali non ricombinanti sono state rilevate come goccioline con genotipizzazione riuscita mediante due sonde alleliche marcate con HEX (riquadri verdi) o con FAM (riquadri blu). Nel grafico a punti della miscela di genotipi parentali (d), le goccioline doppiamente positive per HEX e FAM sono rappresentate da riquadri grigi come falsi positivi + rumore. Le goccioline doppiamente positive per HEX e FAM nelle piante ibride sono popolazioni ricombinanti che includono falsi positivi e rumore, mostrate come riquadri rossi (e). I cluster (I) e (iii) rappresentano goccioline che hanno amplificato con successo un solo marcatore
Il sistema naica® Droplet Chip Digital PCR ha una risoluzione estremamente elevata, quindi nelle goccioline che hanno amplificato con successo il marcatore, è possibile osservare anche i nuclei al loro interno (Figura 2c). I ricercatori hanno ulteriormente ottimizzato l'esperimento analizzando il numero di nuclei incapsulati nelle goccioline e hanno migliorato l'efficienza della genotipizzazione pretrattando i nuclei del polline con enzimi di restrizione termostabili. Poiché il numero di nuclei è positivamente correlato al numero di goccioline che incapsulano un singolo nucleo, viene proposto l'intervallo ottimale per il caricamento dei nuclei (le dimensioni dei nuclei variano a seconda della specie).
Il rilevamento basato su sonde a 2 colori descritto in questo articolo si è rivelato molto efficace e, grazie alla piattaforma a 6 colori, sarà possibile eseguire simultaneamente più gruppi di rilevamento del genotipo, ottenere dati di genotipizzazione multipli e misurare in parallelo il tasso di ricombinazione di più intervalli cromosomici sullo stesso cromosoma o su cromosomi diversi, oppure misurare l'intensità/presenza dell'interferenza CO.
In generale, la genotipizzazione di singoli nuclei di polline d'orzo basata sul sistema di PCR digitale a chip naica® fornisce misurazioni affidabili, rapide e ad alta precisione della ricombinazione meiotica all'interno dello specifico intervallo cromosomico di piante ibride intraspecifiche. L'incapsulamento riuscito di nuclei provenienti da diverse specie con nuclei e genomi di dimensioni differenti dimostra che il metodo proposto è ampiamente applicabile alla genotipizzazione di singoli nuclei.
Il professor Stefan Heckmann e il dottor Yun-Jae Ahn del Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Science (IPK) in Germania hanno condiviso online con noi i risultati della loro ricerca. Se desiderate comprendere intuitivamente i dettagli di questo articolo, cliccate su https://mp.weixin.qq.com/s/KNXVs6rOt8MYpBjzuKZZ9A per guardare il video.
Sistema PCR digitale a sei canali con chip a goccia naica®
Il sistema di PCR digitale a sei canali con chip a gocce naica® di Stilla Technologies, azienda francese, si basa sulla tecnologia di PCR digitale con chip a gocce Crystal. Automatizza la generazione e l'amplificazione delle gocce. Ogni pozzetto del campione è in grado di rilevare 6 canali fluorescenti, identificare in modo intelligente le gocce ed eseguire il controllo di qualità. È possibile ottenere la concentrazione assoluta del numero di copie di almeno 6 geni target entro 3 ore.
