Il sistema di PCR digitale con chip a goccia naica® quantifica con precisione i livelli di trascrizione R613X nel modello di mutazione nonsenso Scn1a della sindrome di Dravet.

28/04/2024

La sindrome di Dravet è una grave epilessia genetica congenita dello sviluppo causata da mutazioni de novo nel gene SCN1A. Le mutazioni nonsenso di SCN1A si riscontrano in circa il 20% dei pazienti e la mutazione SCN1A R613X è stata identificata in diversi pazienti. I ricercatori della Sagol School of Neuroscience, del Dipartimento di Genetica Molecolare Umana e Biochimica e del Goldschleger Eye Institute dell'Università di Tel Aviv, in Israele, hanno pubblicato un articolo intitolato "Heat-induced seizures, premature mortality, and hyperactivity in a novel Scn1a nonsense model for Dravet syndrome" sulla piattaforma bioRxiv.

Gli autori hanno creato un modello murino di Dravet contenente una mutazione nonsenso del gene Scn1a, in cui la mutazione eterozigote Scn1a R613X ha mostrato convulsioni spontanee, suscettibilità alle convulsioni indotte dal calore e morte prematura, riproducendo il fenotipo epilettico principale della sindrome di Dravet. In questo studio, gli autori hanno utilizzato il sistema naica® Droplet Chip Digital PCR per la quantificazione allele-specifica dell'mRNA di Scn1a WT e R613X.

Punti salienti dell'applicazione:

▶ Il sistema naica® Droplet Chip Digital PCR ha quantificato con precisione il contenuto degli alleli mRNA WT Scn1a e R613X nel modello murino di Dravet.

▶ Negli animali eterozigoti, il sistema naica® Droplet Chip Digital PCR ha quantificato i livelli stabili di trascrizione R613X all'8,9±0,9% del tipo selvatico, indicando che le trascrizioni dell'allele mutante subiscono la degradazione dell'RNA mediata da codoni di stop prematuri (NMD) nel tessuto corticale.

Per valutare quantitativamente i livelli di trascritti R613X nella corteccia, è stato utilizzato il sistema naica® Droplet Array Digital PCR per rilevare specificamente Scn1a WT e l'allele R613X.

Risultati:

Il sistema naica® Microdroplet Chip Digital PCR non ha rilevato l'allele R613X nei tessuti corticali dei topi WT, confermando la specificità del metodo (Figura A). L'allele WT è stato rilevato a un livello pari a circa la metà nei tessuti Scn1aWT/R613X rispetto alla corteccia WT, come previsto per gli animali eterozigoti (Figura B). Negli animali eterozigoti, i trascritti mutanti stabili R613X erano pari all'8,9±0,9% (Figura C), molto inferiori al livello previsto del 50%, indicando che i trascritti dell'allele mutante subiscono una forte degradazione mediata da nonsenso (NMD) nei tessuti corticali.

▲Figura. Espressione ridotta dell'mRNA di Scn1a nella corteccia dei topi Scn1aWT/R613X. A. Il tessuto corticale dei topi WT non ha mostrato trascritti dell'allele R613X rilevabili, a dimostrazione della specificità del rilevamento di questo allele. B. Nel tessuto corticale dei topi Scn1aWT/R613X, l'allele Scn1a WT era pari al 48,8% di quello presente nella corteccia WT. C. Il rapporto tra gli alleli R613X e WT ha mostrato che il livello medio allo stato stazionario dell'allele Scn1a R613X negli animali Scn1aWT/R613X era pari all'8,9±0,9% dell'allele WT.

Il link originale è il seguente: https://doi.org/10.1101/2023.02.01.526678

Il sistema di PCR digitale a sei canali naica® di Stilla Technologies, azienda francese, si basa sulla tecnologia di PCR digitale con chip a gocce Crystal, che automatizza la generazione e l'amplificazione delle gocce. Ogni pozzetto del campione è in grado di rilevare 6 canali fluorescenti, identificare in modo intelligente le gocce ed eseguire il controllo di qualità, ottenendo la concentrazione assoluta del numero di copie di almeno 6 geni target entro 3 ore.