PCR digitale multiplex per rilevare il titolo del numero di copie del genoma virale del virus adeno-associato ricombinante (rAAV)

【Introduzione】

Aperbio Xining (Jinghan) Bio ha avviato una collaborazione approfondita per la rilevazione tramite PCR digitale multiplex del titolo del numero di copie del genoma virale del virus adeno-associato ricombinante (rAAV). Questa potente sinergia utilizza la tecnologia PCR digitale Naica Crystal (cdPCR) per ottimizzare il processo di quantificazione del numero di copie del genoma dei virus adeno-associati ricombinanti rAAV2 e rAAV8.

【Panoramica】

Il virus adeno-associato ricombinante (rAAV) è un vettore virale chiave per la terapia genica. Le principali sfide nello sviluppo di questo vettore virale derivano dall'ottimizzazione dei processi a monte e a valle e dalla standardizzazione degli schemi di rilevamento nella produzione su larga scala. Tra questi, la titolazione accurata del numero di copie del genoma del virus adeno-associato ricombinante (rAAV) è direttamente correlata al corretto dosaggio in ambito preclinico e clinico. Stabilire un metodo standard, accurato e riproducibile per la quantificazione del numero di copie del genoma del virus adeno-associato ricombinante (rAAV) è una parte importante dello sviluppo e dell'ottimizzazione dei processi nei prodotti di terapia genica. È stato riportato che l'utilizzo della tecnologia PCR quantitativa a fluorescenza in tempo reale (qPCR) per il rilevamento della titolazione del numero di copie del genoma del virus adeno-associato ricombinante (rAAV) presenta problemi quali la complessa definizione dello standard e la scarsa ripetibilità quantitativa. La tecnologia PCR digitale (dPCR), in quanto nuova tecnologia PCR, consente di quantificare direttamente il numero di copie del genoma del virus adeno-associato ricombinante (rAAV) senza ricorrere a standard e curve standard. Presenta un'elevata tolleranza agli inibitori ed è particolarmente adatta per la rilevazione quantitativa di campioni di lisi virale non purificati.

Figura 1. Produzione del virus adeno-associato ricombinante (rAAV)

(1) Quando il plasmide vettore di espressione fiancheggiato da ITR contenente la sequenza del gene bersaglio è stato cotrasfettato con

(3) il plasmide helper dell'adenovirus nelle cellule HEK-293, l'efficienza di produzione del vettore AAV era coerente con quella quando l'adenovirus veniva utilizzato per l'infezione.

【 Scopo sperimentale 】

Abbiamo utilizzato la tecnologia PCR digitale Naica Crystal (cdPCR) per ottimizzare il metodo di quantificazione simultanea del numero di copie di tre diversi siti genici nel vettore plasmidico del virus adeno-associato ricombinante (rAAV) e nel genoma virale: ITR (marcatore CY5), EGFP (GOI, marcatore HEX) ed elemento regolatore della trascrizione WPRE (marcatore FAM). Nell'analisi dei dati, sono state descritte e confrontate le condizioni degli schemi di pretrattamento di diversi campioni virali. È emerso che la linearizzazione della struttura a forcina dell'ITR e le condizioni di clivaggio della proteina del capside nello schema di pretrattamento del campione virale erano particolarmente importanti per l'accuratezza della quantificazione del numero di copie del genoma virale, fornendo una base per la definizione di un metodo di rilevamento standard per la PCR digitale nel sistema di controllo qualità dei vettori virali per la terapia genica.

【Schema di rilevamento quantitativo per il titolo del numero di copie del genoma virale di rAAV】