Scopri come eseguire il test di genotipizzazione KASP utilizzando lo strumento qPCR Pangaea in cinque minuti.

28/04/2024

Cos'è KASP?

KASP (Kompetitive Allele Specific PCR) è una nuova tecnologia di genotipizzazione basata sui polimorfismi a singolo nucleotide (SNP). Questa tecnologia si basa sulla lettura della fluorescenza dopo la reazione di PCR. Ogni pozzetto utilizza una fluorescenza a doppio colore per rilevare due possibili genotipi di un campione e di un sito. È uno dei metodi di genotipizzazione più efficienti ed economici. Vediamo come eseguire la rilevazione del genotipo KASP utilizzando lo strumento Pangu qPCR.

Flusso di lavoro KASP

Passaggio 1:

Progettare le sonde e i primer corrispondenti. Ci sono in totale tre primer, due tipizzanti a monte con connettori fluorescenti e uno universale a valle (Figura A sotto). Ci sono in totale quattro sonde, due sonde fluorescenti e due sonde di spegnimento (Figura B sotto). Le sonde fluorescenti e le sonde di spegnimento sono complementari e le sonde fluorescenti sono coerenti con la sequenza del connettore (sequenza del tag) degli specifici primer a monte.

Passaggio 2:

L'amplificazione PCR viene eseguita tramite uno strumento qPCR. Nel primo ciclo di amplificazione PCR, il primer allele-specifico (l'estremità 3' può essere appaiata) identifica lo specifico stampo allelico e completa il riconoscimento dell'allele. Anche il primer universale inverso si lega e completa l'intero processo PCR. In questa fase, la sonda marcata con fluoroforo è ancora legata alla sua sonda di spegnimento complementare e non viene generato alcun segnale fluorescente. A partire dal secondo ciclo di amplificazione PCR, nel prodotto compare uno stampo contenente una sequenza di tag universale. Questo passaggio completa l'introduzione della sequenza di tag universale nel prodotto PCR corrispondente al SNP. Successivamente, la sonda fluorescente viene aggiunta al prodotto PCR legandosi alla catena di DNA complementare al tag, in modo che non si leghi più alla sua sonda di spegnimento complementare, generando così un segnale fluorescente.

Come garantire che la sonda e il primer si leghino come previsto durante il processo PCR?

Grazie al programma touchdown PCR impostato, è possibile garantire il legame separato della sonda e del primer. Quando la temperatura di annealing è elevata, il primer si lega inizialmente in modo specifico al filamento stampo grazie al suo alto valore di Tm, e successivamente amplifica il DNA sotto l'azione dell'enzima Taq, aumentando così la quantità di DNA stampo originale disponibile per l'amplificazione della sonda. Man mano che la temperatura di annealing diminuisce, la sonda inizia a legarsi al filamento stampo e produce un segnale fluorescente.

Passo 3:

Dopo aver eseguito il test Pangu qPCR, è possibile ottenere i dati KASP tramite il menu di analisi SNP.

Il sistema PCR in tempo reale di Pangaea supporta il rilevamento della genotipizzazione KASP

•La velocità di riscaldamento può raggiungere 8,5℃/s e 96 reazioni di genotipizzazione possono essere completate rapidamente in una volta e i risultati possono essere rilasciati, con elevata resa del prodotto e buona specificità

•La precisione del controllo della temperatura di ±0,1℃ soddisfa i rigorosi requisiti di KASP per la temperatura di amplificazione, garantendo la specificità nell'identificazione delle differenze di singole basi.

•Supporta la funzione di gradiente di temperatura a 12 colonne, utile per ottimizzare rapidamente le condizioni necessarie per l'amplificazione KASP

•Rilevamento della parte superiore della guida d'onda ottica, nessun effetto di bordo e differenza di percorso ottico, nessuna calibrazione richiesta

•Canale di rilevamento a 6 colori, supporta vari marcatori fluorescenti di uso comune ed è compatibile con i kit di tipizzazione KASP di uso comune

Applicazione KASP

La tecnologia KASP è flessibile, economica e precisa. Rispetto ad altre tecnologie, offre una certa flessibilità e consente di ottenere facilmente analisi ad alta produttività e automatizzate. Inoltre, KASP utilizza una sonda universale che può essere impiegata in combinazione con diversi primer gene-specifici, senza la necessità di sintetizzare sonde per ogni singolo sito, riducendo così i costi dei reagenti. Questa tecnologia è ampiamente utilizzata nei settori del miglioramento genetico animale e vegetale, dell'identificazione delle risorse genetiche, della costruzione di mappe genetiche e dell'identificazione della purezza delle sementi.