La PCR digitale con chip a goccia naica® rileva l'eteroplasmia mitocondriale dopo il trasferimento nucleare, ottenendo risultati in 2,5 ore.

Le malattie mitocondriali sono un tipo di disturbo genetico causato da mutazioni genetiche nel genoma mitocondriale (mtDNA), che si trasmettono esclusivamente per via materna. Solitamente, mutazioni in oltre il 60% del DNA mitocondriale delle cellule possono causare malattie, e maggiore è il numero di mutazioni del DNA mitocondriale presenti in una persona, più grave diventa la malattia.

Attualmente, il trapianto nucleare (NT), noto anche come donazione mitocondriale, sta ricevendo sempre maggiore attenzione come strategia per prevenire la trasmissione di malattie mitocondriali dalle madri malate alla prole. Tuttavia, a causa della presenza di una piccola quantità di mtDNA di origine citoplasmatica nel trapianto nucleare, che media l'eterogeneità e l'amplificazione del mtDNA nel ricevente, è necessaria una quantificazione accurata del carico mutazionale del mtDNA. I limiti degli attuali metodi di sequenziamento NGS sono rappresentati da costi elevati, tempi lunghi, elaborazione complessa dei dati e basso rapporto segnale/rumore.

La neuropatia ottica ereditaria di Leber (LHON) è la più comune malattia mitocondriale a trasmissione materna. Un team di esperti del Dipartimento di Biologia dell'Università di Gand, in Belgio, ha utilizzato la piattaforma PCR digitale (dPCR) per rilevare la mutazione m.11778 G>A associata alla LHON e l'ha confrontata con il metodo NGS per valutare l'applicabilità della PCR digitale nella quantificazione dell'eterogeneità del mtDNA. I risultati della ricerca sono stati pubblicati sulla prestigiosa rivista Clinical Chemistry.

Per valutare l'applicabilità della dPCR nella valutazione dell'eterogeneità, sono stati predisposti tre tipi di campioni: (i) 13 campioni provenienti da pazienti con un elevato carico mutazionale; (ii) Tre campioni omogenei di tipo selvatico donati da volontari sani; (iii) Campioni trattati con NT che presentano un basso carico mutazionale dovuto a residui di mtDNA, per un totale di 6 campioni.

Metodo di prova:

In fase di elaborazione, l'intervallo di carico mutazionale del campione viene impostato tra il 50% e lo 0,01% per l'analisi e la validazione.

Conclusione sperimentale:

I tassi di mutazione osservati nei risultati dPCR e NGS hanno mostrato una buona concordanza.

Rispetto alla NGS, la dPCR presenta un rumore di fondo inferiore. L'utilizzo del sistema di PCR digitale a chip a gocce Naica® non ha mostrato alcun segnale positivo per gli alleli mutanti nei campioni non provenienti da pazienti, come previsto.

Rispetto ai risultati della dPCR, le frequenze dell'allele secondario di quasi tutti i campioni eterogenei sono risultate sovrastimate nei risultati del sequenziamento di nuova generazione (NGS). Si ipotizza preliminarmente che sequenze errate possano essere state introdotte nel processo sperimentale NGS e che le frequenze dell'allele secondario siano state alterate tramite amplificazione PCR.

Rispetto al sequenziamento di nuova generazione (NGS), la PCR digitale ha costi inferiori, un funzionamento più semplice, risultati più intuitivi ed è più adatta al rilevamento di mutazioni a bassa frequenza.

Il metodo PCR digitale è adatto per la rilevazione quantitativa dell'eterogeneità mitocondriale dopo il trapianto nucleare.