जौ के परागकणों के नाभिकों में अर्धसूत्री विभाजन पुनर्संयोजन दर के उच्च-थ्रूपुट निर्धारण के लिए नाइका® ड्रॉपलेट चिप डिजिटल पीसीआर प्रणाली

2024-05-07

अर्धसूत्री विभाजन समरूप पुनर्संयोजन (एचआर) पर आधारित अगुणित कोशिकाओं और आनुवंशिक विविधता का उत्पादन करके लैंगिक प्रजनन में सहायक होता है। एचआर पुनर्संयोजक विनिमय (सीओ), समरूप गुणसूत्रों के बीच समरूपता, परिपथ आदि के माध्यम से अर्धसूत्री गुणसूत्र पृथक्करण सुनिश्चित करता है, साथ ही आनुवंशिक विविधता को प्रजनन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हुए उसे बनाए रखता है।

पौधों में, समरूप पुनर्संयोजन का पता कई तकनीकों द्वारा लगाया जा सकता है, जैसे कि अर्धसूत्री विभाजन गुणसूत्र विश्लेषण के माध्यम से कोशिका संबंधी पहचान, अनुक्रमण और आणविक मार्करों द्वारा जीनोटाइपिंग, या पृथक्कृत आबादी में प्रतिदीप्ति-लक्षित रेखाओं (एफटीएल) का उपयोग। एफटीएल, अरेबिडोप्सिस में पराग या बीजों में अर्धसूत्री विभाजन पुनर्संयोजन घटनाओं को मापने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हैं। हालांकि, एफटीएल फसलों के लिए उपयुक्त नहीं हैं क्योंकि विशेष रूप से बड़े जीनोम वाली फसलों में एफटीएल उत्पन्न करना श्रमसाध्य और महंगा होता है। इसके अलावा, विभिन्न फसलें या कुछ जीनोटाइप आनुवंशिक रूपांतरण के लिए उपयुक्त नहीं होते हैं। एक विकल्प के रूप में, अर्धसूत्री विभाजन उत्पादों में अर्धसूत्री विभाजन पुनर्संयोजन के परिणामों का सीधे पता लगाने के लिए माइक्रोस्पोर (टेट्राड या पराग केंद्रक) जीनोटाइपिंग या अनुक्रमण का उपयोग किया जाता है। हालांकि, फसल माइक्रोस्पोर का अनुक्रमण/जीनोटाइपिंग काफी महंगा है, इसलिए किए जा सकने वाले परीक्षणों की संख्या सीमित है, विशेष रूप से अनाज जैसी बड़े जीनोम वाली प्रजातियों के लिए।

निषेचन से पहले नर युग्मकों की अर्धसूत्री विभाजन पुनर्संयोजन दर को मापने के कई लाभ हैं, जैसे कि बड़े नमूने, स्वतंत्र आणविक मार्कर विश्लेषण और तत्काल पुनर्संयोजन विनिमय विश्लेषण, लेकिन युग्मक डीएनए की मात्रा सीमित होती है, और अनुक्रमण/जीनोटाइपिंग विधियाँ आमतौर पर संपूर्ण जीनोम प्रवर्धन (WGA) पर निर्भर करती हैं। अगुणित युग्मकों में डीएनए की कम मात्रा के कारण पीसीआर प्रतिक्रियाओं के माध्यम से एकल युग्मकों का सीधे जीनोटाइपिंग भी असंभव है। जौ में, एकल परागकण केंद्रक जीनोटाइपिंग अंतःप्रजातीय संकरों से एकल अगुणित परागकण केंद्रकों को प्रतिदीप्ति सक्रिय कोशिका छँटाई द्वारा अलग करके, उसके बाद WGA और बहु-स्थानिक KASP जीनोटाइपिंग या एकल-कोशिका जीनोम अनुक्रमण द्वारा पूर्ण किया जाता है। एकल अगुणित परागकण केंद्रक का डीएनए सीमित होता है, और WGA की लागत अधिक होती है, जिसके परिणामस्वरूप विश्लेषित नमूनों की संख्या सीमित होती है और उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण पूर्ण करना संभव नहीं होता है।

जर्मनी के लाइबनिज़ इंस्टीट्यूट ऑफ प्लांट जेनेटिक्स एंड क्रॉप प्लांट रिसर्च के वैज्ञानिकों ने हाल ही में द प्लांट जर्नल में अर्धसूत्री विभाजन पुनर्संयोजन दर मापन पर एक शोध पत्र प्रकाशित किया है। यह लेख युग्मकों में अर्धसूत्री विभाजन पुनर्संयोजन दर को मापने के लिए नाइका® ड्रॉपलेट चिप डिजिटल पीसीआर प्रणाली का उपयोग करता है, जिससे उच्च-थ्रूपुट और कम लागत वाला जीनोटाइपिंग प्राप्त होता है।

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नाइका® ड्रॉपलेट चिप डिजिटल पीसीआर प्रणाली पर आधारित जीनोटाइपिंग विश्लेषण का उपयोग करके, जौ के परागकणों के नाभिकों में अर्धसूत्रीय पुनर्संयोजन दरों का उच्च-थ्रूपुट मापन बड़ी मात्रा में पूर्व-निष्पादित डब्ल्यूजीए (WGA) के बिना पूरा किया जा सकता है। पराग प्राप्त करने के बाद, परागकणों में मौजूद नाभिकों को निकालकर फ्लो साइटोमेट्री द्वारा शुद्ध किया जाता है। प्राप्त परागकणों को अर्धसूत्रीय पुनर्संयोजन दर ज्ञात करने के लिए नाइका® ड्रॉपलेट चिप डिजिटल पीसीआर प्रणाली के मिश्रण में मिलाया जाता है। कुल 42,000 से अधिक व्यक्तिगत परागकणों (प्रति पौधे 4900 नाभिक तक) की जीनोटाइपिंग करके, संकर पौधों में दो सेंट्रोमियर और दो दूरस्थ गुणसूत्र अंतरालों के भीतर अर्धसूत्रीय पुनर्संयोजन दरों का मापन किया जाता है। परागकण नाभिक में निर्धारित पुनर्संयोजन आवृत्ति, पृथक्कृत जनसंख्या में पाई गई आवृत्ति के लगभग समान होती है।

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▲ चित्र 1: नाइका® ड्रॉपलेट चिप डिजिटल पीसीआर सिस्टम का उपयोग करके जौ के एकल परागकण केंद्रक जीनोटाइपिंग के लिए कार्यप्रणाली। (क) संकर पौधों के परागकोष; (ख) अलग-अलग जाली आकार (100 और 20 μm) वाले फिल्टर का उपयोग करके निलंबन में पराग और परागकण केंद्रकों को अलग किया जाता है। (ग) परागकण केंद्रकों को प्रोपिडियम आयोडाइड से रंगा जाता है और डिजिटल पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण में प्रवाह-क्रमबद्ध किया जाता है। (घ) 25 μl डिजिटल पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण (क्रमबद्ध परागकण केंद्रकों सहित) को नीलम चिप के चार कक्षों में से एक में डाला जाता है। (ङ) जियोड में ड्रॉपलेट निर्माण और थर्मल साइक्लिंग की जाती है। (च) थर्मल साइक्लिंग के बाद, नीलम चिप को नाइका® प्रिज्म 3 में स्कैन किया गया और क्रिस्टल माइनर सॉफ्टवेयर में डेटा विश्लेषण किया गया।

इस लेख में परागकण नाभिकों की अर्धसूत्रीय पुनर्संयोजन दर का पता लगाने के लिए दोहरी जांच विधि का उपयोग किया गया। उदाहरण के लिए, पिछले व्यवहार्यता सत्यापन में पता लगाए गए InDel3118 और InDel3135 के बीच अंतराल Id 3-1 को बार्के (B) एलील-विशिष्ट जांच (हरा) के लिए HEX और मोरेक्स (M) एलील-विशिष्ट जांच (नीला) के लिए FAM से चिह्नित किया गया (चित्र 2b)। शोधकर्ताओं ने पैतृक जीनोटाइप से परागकण नाभिकों को 1:1 अनुपात में मिलाया और Id 3-1 के लिए विषमयुग्मजी संकर पौधों से परागकण नाभिकों का भी पता लगाया। पैतृक मिश्रित नमूना परीक्षण में, दोनों पैतृक जीनोटाइप की बूंदें बराबर थीं, और दोनों मार्करों ने समान प्रतिदीप्ति दिखाई (B के लिए HEX या M के लिए FAM) (चित्र 2b)। संकर सामग्री के नमूनों की पहचान में, यह उम्मीद की जाती है कि पुनर्संयोजन घटनाओं का प्रतिनिधित्व करने वाले विभिन्न बूंद समूह दिखाई देंगे, अर्थात्, एक ही समय में दो रंग दिखाने वाली बूंदें (InDel3118 के लिए HEX और InDel3135 के लिए FAM, और इसके विपरीत) (चित्र 2b)। वास्तविक पहचान में, यह पाया गया कि पैतृक जीनोटाइपों ने लगभग समान संख्या में बूंदें प्राप्त कीं, जिन्होंने दोनों मार्करों के लिए समान प्रतिदीप्ति दिखाई (चित्र 2d, e, हरे और नीले आयत)। संकर पौधों के पराग नाभिकों की पहचान में, दो रंगों (HEX और FAM) वाली बूंदें पाई गईं, जो पुनर्संयोजन घटनाओं को दर्शाती हैं (चित्र 2e, लाल आयत)। इसके अलावा, ऐसी बूंदों को अलग किया जा सकता है जिनमें केवल एक मार्कर का सफलतापूर्वक प्रवर्धन हुआ (चित्र 2d, e, समूह I और iii) और बिना किसी प्रवर्धन वाली बूंदों को (चित्र 2d, e, समूह ii)। इससे पता चलता है कि नाइका® ड्रॉपलेट चिप डिजिटल पीसीआर प्रणाली का उपयोग करके एकल पराग नाभिक को एनकैप्सुलेट करना और उसका जीनोटाइप करना पूरी तरह से संभव है।

▲ चित्र 2. नाइका® ड्रॉपलेट चिप डिजिटल पीसीआर सिस्टम का उपयोग करके जौ के परागकणों के नाभिकों का जीनोटाइपिंग। (क) जौ के गुणसूत्र 1 और 3 पर चार गुणसूत्र अंतरालों को परिभाषित करने वाले इनडेल या एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता (एसएनपी) मार्कर। (ख) आईडी 3-1 को उदाहरण के रूप में उपयोग करते हुए नाइका® ड्रॉपलेट चिप डिजिटल पीसीआर सिस्टम पर आधारित परागकणों के नाभिकों का जीनोटाइपिंग विश्लेषण: दो प्रतिदीप्त जांचों के संभावित संयोजन पुनर्संयोजित और गैर-पुनर्संयोजित परागकणों के नाभिकों के बीच अंतर करने में सक्षम बनाते हैं। (ग) सक्रिय ड्रॉपलेट ऐरे का कच्चा दृश्य। प्रत्येक कक्ष में आमतौर पर लगभग 25,000 स्थिर सक्रिय ड्रॉपलेट होते हैं। किसी भी चैनल (एफएएम या एचईएक्स) में सफलतापूर्वक प्रवर्धित ड्रॉपलेट हल्के भूरे रंग के होते हैं, जबकि गहरे भूरे रंग के ड्रॉपलेट नकारात्मक होते हैं। (d, e) चिप चैंबर से प्राप्त पराग नाभिकों के जीनोटाइपिंग डेटा को Naica® ड्रॉपलेट चिप डिजिटल पीसीआर सिस्टम के आधार पर सॉफ्टवेयर में डॉट प्लॉट के रूप में प्रदर्शित किया गया है। इसमें 1:1 अनुपात में मिश्रित पैतृक जीनोटाइपों के पराग नाभिक (d) और आईडी 3-1 वाले विषमयुग्मजी संकर पौधों के पराग नाभिक शामिल हैं। (e) दो गैर-पुनर्संयोजित जनक आबादी को दो HEX-लेबल वाले (हरे बॉक्स) या FAM-लेबल वाले एलील प्रोब (नीले बॉक्स) द्वारा सफल जीनोटाइपिंग वाले ड्रॉपलेट्स के रूप में पहचाना गया। पैतृक जीनोटाइप मिश्रण (d) के डॉट प्लॉट में, HEX और FAM डबल-पॉजिटिव ड्रॉपलेट्स को ग्रे बॉक्स द्वारा फॉल्स पॉजिटिव + नॉइज़ के रूप में दर्शाया गया है। संकर पौधों में HEX और FAM डबल-पॉजिटिव ड्रॉपलेट्स रिकॉम्बिनेंट आबादी हैं जिनमें फॉल्स पॉजिटिव और नॉइज़ शामिल हैं, जिन्हें लाल बॉक्स (e) द्वारा दर्शाया गया है। क्लस्टर (I) और (iii) उन ड्रॉपलेट्स को दर्शाते हैं जिन्होंने केवल एक मार्कर को सफलतापूर्वक एम्प्लीफाई किया।

नाइका® ड्रॉपलेट चिप डिजिटल पीसीआर सिस्टम में अत्यंत उच्च रिज़ॉल्यूशन होता है, इसलिए जिन बूंदों में मार्कर का सफल प्रवर्धन हुआ, उनमें मौजूद नाभिकों को भी देखा जा सकता है (चित्र 2c)। शोधकर्ताओं ने बूंदों में समाहित नाभिकों की संख्या का विश्लेषण करके प्रयोग को और अधिक अनुकूलित किया, और पराग नाभिकों को ऊष्मास्थिर प्रतिबंध एंजाइमों से पूर्व-उपचारित करके जीनोटाइपिंग की दक्षता में सुधार किया। चूंकि नाभिकों की संख्या एक नाभिक को समाहित करने वाली बूंदों की संख्या के साथ सकारात्मक रूप से सहसंबंधित है, इसलिए नाभिकों को लोड करने के लिए इष्टतम अंतराल प्रस्तावित किया गया है (विभिन्न प्रजातियों में विभिन्न आकारों के विभिन्न नाभिक भिन्न होते हैं)।

इस शोधपत्र में 2-रंगों वाले प्रोब पर आधारित पहचान बेहद सफल रही है, और आगे 6-रंगों वाले प्लेटफॉर्म के माध्यम से, एक साथ अधिक समूहों की जीनोटाइपिंग पहचान की जा सकती है, कई जीनोटाइपिंग डेटा प्राप्त किए जा सकते हैं, और एक ही या अलग-अलग गुणसूत्रों पर एक से अधिक गुणसूत्र अंतराल की पुनर्संयोजन दर को समानांतर रूप से मापा जा सकता है, या CO हस्तक्षेप की तीव्रता/उपस्थिति को मापा जा सकता है।

सामान्य तौर पर, नाइका® ड्रॉपलेट चिप डिजिटल पीसीआर प्रणाली पर आधारित एकल जौ परागकण नाभिकों का जीनोटाइपिंग, अंतःप्रजातीय संकर पौधों के निर्दिष्ट गुणसूत्र अंतराल के भीतर विश्वसनीय, तीव्र और उच्च परिशुद्धता वाले अर्धसूत्री विभाजन पुनर्संयोजन माप प्रदान करता है। विभिन्न नाभिकों और जीनोम आकारों वाली प्रजातियों के नाभिकों का सफल एनकैप्सुलेशन दर्शाता है कि प्रस्तावित विधि एकल नाभिकों के जीनोटाइपिंग के लिए व्यापक रूप से लागू की जा सकती है।

जर्मनी के लाइबनिज़ इंस्टीट्यूट ऑफ प्लांट जेनेटिक्स एंड क्रॉप साइंस (आईपीके) के प्रोफेसर स्टीफ़न हेकमैन और डॉ. युन-जे आन ने भी अपने शोध परिणाम ऑनलाइन हमारे साथ साझा किए हैं। यदि आप इस लेख की बारीकियों को सहजता से समझना चाहते हैं, तो कृपया इसे देखने के लिए https://mp.weixin.qq.com/s/KNXVs6rOt8MYpBjzuKZZ9A पर क्लिक करें।

नाइका® छह-चैनल ड्रॉपलेट चिप डिजिटल पीसीआर प्रणाली

फ्रांस की स्टिला टेक्नोलॉजीज का नाइका® छह-चैनल ड्रॉपलेट चिप डिजिटल पीसीआर सिस्टम क्रिस्टल ड्रॉपलेट चिप डिजिटल पीसीआर तकनीक पर आधारित है। यह ड्रॉपलेट निर्माण और प्रवर्धन को स्वचालित करता है। प्रत्येक सैंपल वेल 6 फ्लोरोसेंट चैनलों का पता लगा सकता है, ड्रॉपलेट्स की बुद्धिमानी से पहचान कर सकता है और गुणवत्ता नियंत्रण कर सकता है। कम से कम 6 लक्षित जीनों की पूर्ण प्रतिलिपि संख्या सांद्रता 3 घंटे के भीतर प्राप्त की जा सकती है।