रिकॉम्बिनेंट एडिनो-एसोसिएटेड वायरस (आरएएवी) के वायरल जीनोम कॉपी संख्या के टाइटर का पता लगाने के लिए मल्टीप्लेक्स डिजिटल पीसीआर का उपयोग किया जाता है।

【परिचय】

एपरबियो शिनिंग (जिंगहान) बायो ने रिकॉम्बिनेंट एडिनो-एसोसिएटेड वायरस (आरएएवी) के वायरल जीनोम कॉपी संख्या के टाइटर का मल्टीप्लेक्स डिजिटल पीसीआर डिटेक्शन करने के लिए गहन सहयोग शुरू किया है। यह शक्तिशाली संयोजन रिकॉम्बिनेंट एडिनो-एसोसिएटेड वायरस आरएएवी2 और आरएएवी8 के जीनोम कॉपी संख्या मात्रा निर्धारण प्रक्रिया को अनुकूलित करने के लिए नाइका क्रिस्टल डिजिटल पीसीआर तकनीक (सीडीपीसीआर) का उपयोग करता है।

【अवलोकन】

रिकॉम्बिनेंट एडिनो-एसोसिएटेड वायरस (rAAV) जीन थेरेपी के लिए एक प्रमुख वायरल वेक्टर है। इस वायरल वेक्टर के विकास में मुख्य चुनौतियाँ बड़े पैमाने पर उत्पादन में प्रारंभिक और अंतिम प्रक्रियाओं के अनुकूलन और पहचान योजनाओं के मानकीकरण से संबंधित हैं। इनमें से, रिकॉम्बिनेंट एडिनो-एसोसिएटेड वायरस (rAAV) जीनोम कॉपी संख्या का सटीक अनुमापन प्रीक्लिनिकल और क्लिनिकल वातावरण में सही खुराक से सीधे संबंधित है। रिकॉम्बिनेंट एडिनो-एसोसिएटेड वायरस (rAAV) जीनोम कॉपी संख्या की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक मानक, सटीक और पुनरुत्पादनीय विधि स्थापित करना जीन थेरेपी उत्पादों में प्रक्रिया विकास और अनुकूलन का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है। यह बताया गया है कि रिकॉम्बिनेंट एडिनो-एसोसिएटेड वायरस (rAAV) जीनोम कॉपी संख्या के अनुमापन पहचान के लिए रियल-टाइम फ्लोरेसेंस क्वांटिटेटिव पीसीआर (qPCR) तकनीक के उपयोग में जटिल मानक स्थापना और खराब मात्रात्मक पुनरावर्तन जैसी समस्याएं हैं। डिजिटल पीसीआर (dPCR) तकनीक, एक नई पीसीआर तकनीक के रूप में, मानकों और मानक वक्रों पर निर्भर किए बिना, पुनर्योजी एडेनो-एसोसिएटेड वायरस (rAAV) जीनोम की प्रतिलिपि संख्या को सीधे निर्धारित कर सकती है। इसमें अवरोधकों के प्रति उच्च सहनशीलता है और यह विशेष रूप से अशुद्ध वायरस लाइसिस नमूनों के मात्रात्मक पता लगाने के लिए उपयुक्त है।

चित्र 1. रिकॉम्बिनेंट एडिनो-एसोसिएटेड वायरस (rAAV) का उत्पादन

(1) जब लक्षित जीन अनुक्रम को ले जाने वाले ITR-युक्त अभिव्यक्ति वेक्टर प्लास्मिड को सह-ट्रांसफेक्ट किया गया, तो

(3) एडेनोवायरस हेल्पर प्लास्मिड को HEK-293 कोशिकाओं में डालने पर, AAV वेक्टर की उत्पादन दक्षता एडेनोवायरस के संक्रमण के लिए उपयोग किए जाने पर सुसंगत थी।

【प्रायोगिक उद्देश्य】

हमने रिकॉम्बिनेंट एडिनो-एसोसिएटेड वायरस (rAAV) प्लास्मिड वेक्टर और वायरल जीनोम में तीन अलग-अलग जीन साइटों - ITR (CY5 मार्कर), EGFP (GOI, HEX मार्कर) और ट्रांसक्रिप्शन-संबंधित नियामक तत्व WPRE (FAM मार्कर) - की एक साथ प्रतिलिपि संख्या मात्रा निर्धारण के लिए विधि को अनुकूलित करने हेतु नाइका क्रिस्टल डिजिटल पीसीआर तकनीक (cdPCR) का उपयोग किया। डेटा विश्लेषण में, विभिन्न वायरस नमूनों की पूर्व-उपचार योजनाओं की स्थितियों का वर्णन और तुलना की गई। यह पाया गया कि वायरस नमूने की पूर्व-उपचार योजना में ITR हेयरपिन संरचना का रेखीयकरण और कैप्सिड प्रोटीन की विखंडन स्थितियाँ वायरल जीनोम प्रतिलिपि संख्या के मात्रा निर्धारण की सटीकता के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण थीं, जिससे जीन थेरेपी वायरल वेक्टर की गुणवत्ता नियंत्रण प्रणाली में डिजिटल पीसीआर विधि के लिए एक मानक पहचान विधि स्थापित करने का आधार प्राप्त हुआ।

【 rAAV वायरल जीनोम कॉपी संख्या टाइटर के लिए मात्रात्मक पहचान योजना 】