Système d'extraction d'acides nucléiques qMate Mini
Sciences de la vie
Système de PCR numérique sur puce à gouttelettes naica® pour la détermination à haut débit du taux de recombinaison méiotique dans les noyaux de pollen d'orge
2024-05-07
La méiose permet la reproduction sexuée en produisant des cellules haploïdes et une variation génétique basée sur la recombinaison homologue (RH). La RH assure la ségrégation des chromosomes méiotiques par le biais d'échanges recombinants (OR), de la synapsis entre chromosomes homologues, du crossing-over, etc., garantissant ainsi que la variation génétique joue un rôle dans la sélection.
Chez les plantes, la recombinaison homologue peut être détectée par plusieurs techniques, telles que la détection cytologique par analyse des chromosomes méiotiques, le génotypage par séquençage et l'utilisation de marqueurs moléculaires ou de lignées fluorescentes (FTL) dans des populations en ségrégation. Les FTL constituent un outil puissant pour mesurer les événements de recombinaison méiotique dans le pollen ou les graines d'Arabidopsis. Cependant, les FTL ne conviennent pas aux cultures car leur production est laborieuse et coûteuse, notamment pour les espèces à génome particulièrement grand. De plus, certaines cultures ou certains génotypes ne se prêtent pas à la transformation génétique. En alternative, le génotypage ou le séquençage des microspores (tétrades ou noyaux de pollen) permet de détecter directement les résultats de la recombinaison méiotique dans les produits de la méiose. Toutefois, le séquençage/génotypage des microspores de cultures est très coûteux, ce qui limite le nombre de tests réalisables, en particulier pour les espèces à génome important comme les céréales.
La mesure du taux de recombinaison méiotique des gamètes mâles avant la fécondation présente l'avantage d'un échantillon de grande taille, d'une analyse indépendante des marqueurs moléculaires et d'une analyse immédiate des échanges de recombinaison. Cependant, la quantité d'ADN des gamètes étant limitée, les méthodes de séquençage/génotypage reposent généralement sur l'amplification du génome entier (WGA). Le génotypage direct de gamètes uniques par PCR est également impossible en raison de la faible quantité d'ADN des gamètes haploïdes. Chez l'orge, le génotypage de noyaux polliniques uniques est réalisé en séparant les noyaux polliniques haploïdes uniques des hybrides intraspécifiques par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), suivi d'une WGA et d'un génotypage KASP multilocus ou d'un séquençage du génome unicellulaire. La quantité d'ADN d'un noyau pollinique haploïde unique étant limitée et le coût de la WGA élevé, le nombre d'échantillons analysables est restreint et le débit d'analyse impossible.
Des scientifiques de l'Institut Leibniz de génétique végétale et de recherche sur les plantes cultivées, en Allemagne, ont récemment publié dans The Plant Journal un article sur la mesure du taux de recombinaison méiotique. Cet article utilise le système de PCR numérique sur puce à gouttelettes naica® pour mesurer ce taux dans les gamètes, permettant ainsi un génotypage à haut débit et à faible coût.
L'analyse de génotypage basée sur le système de PCR numérique sur puce à gouttelettes naica® permet la mesure à haut débit des taux de recombinaison méiotique dans les noyaux de pollen d'orge, sans nécessiter une amplification du génome entier (WGA) préalable importante. Après la récolte du pollen, les noyaux sont extraits et purifiés par cytométrie en flux. Ces noyaux sont ensuite ajoutés au mélange réactionnel du système de PCR numérique sur puce à gouttelettes naica® pour la détection et la détermination du taux de recombinaison méiotique. Le génotypage de plus de 42 000 noyaux de pollen (jusqu'à 4 900 par plante) permet de mesurer les taux de recombinaison méiotique au sein de deux centromères et sur deux intervalles chromosomiques distants chez les plantes hybrides. La fréquence de recombinaison déterminée dans les noyaux de pollen est proche de celle observée dans la population en ségrégation.
▲ Figure 1 : Protocole de génotypage de noyaux polliniques uniques d’orge à l’aide du système de PCR numérique sur puce à gouttelettes naica®. (a) Anthères de plantes hybrides ; (b) Séparation du pollen et des noyaux polliniques en suspension par filtration sur membrane de mailles différentes (100 et 20 µm) ; (c) Coloration des noyaux polliniques à l’iodure de propidium et tri par cytométrie de flux dans le mélange réactionnel de PCR numérique ; (d) Chargement de 25 µl de mélange réactionnel de PCR numérique (contenant les noyaux polliniques triés) dans l’une des quatre chambres de la puce saphir ; (e) Génération des gouttelettes et cyclage thermique réalisés avec Geode ; (f) Scan de la puce saphir avec naica® Prism 3 et analyse des données avec le logiciel Crystal Miner.
Cet article utilise une méthode à double sonde pour détecter le taux de recombinaison méiotique des noyaux de pollen. Par exemple, l'intervalle Id 3-1 entre InDel3118 et InDel3135, détecté lors de la précédente étude de faisabilité, a été marqué avec du HEX (vert) pour la sonde spécifique de l'allèle Barke (B) et avec du FAM (bleu) pour la sonde spécifique de l'allèle Morex (M) (Figure 2b). Les chercheurs ont mélangé des noyaux de pollen issus des génotypes parentaux dans un rapport 1:1 et ont également analysé des noyaux de pollen de plantes hybrides hétérozygotes pour Id 3-1. Dans le test avec l'échantillon mixte parental, les gouttelettes des deux génotypes parentaux étaient de taille égale et les deux marqueurs présentaient la même fluorescence (HEX pour B ou FAM pour M) (Figure 2b). Lors de la détection d'échantillons de matériel hybride, on s'attend à observer différents groupes de gouttelettes représentant des événements de recombinaison, c'est-à-dire des gouttelettes présentant simultanément deux couleurs (HEX pour InDel3118 et FAM pour InDel3135, et inversement) (Figure 2b). Lors de la détection, il a été constaté que les génotypes parentaux présentaient un nombre approximativement égal de gouttelettes, avec une fluorescence identique pour les deux marqueurs (Figure 2d, e, rectangles vert et bleu). Lors de la détection des noyaux de pollen de plantes hybrides, des gouttelettes bicolores (HEX et FAM) ont été observées, indiquant des événements de recombinaison (Figure 2e, rectangle rouge). De plus, il est possible de distinguer les gouttelettes dans lesquelles un seul marqueur a été amplifié (Figure 2d, e, groupes 1 et iii) et celles sans amplification (Figure 2d, e, groupe ii). Cela montre qu'il est tout à fait possible d'encapsuler et de génotyper des noyaux de pollen individuels à l'aide du système de PCR numérique sur puce à gouttelettes naica®.
▲ Figure 2. Génotypage des noyaux de pollen d'orge par PCR numérique sur puce à gouttelettes naica®. (a) Marqueurs InDel ou polymorphisme nucléotidique simple (SNP) définissant quatre intervalles chromosomiques sur les chromosomes 1 et 3 de l'orge. (b) Analyse du génotypage des noyaux de pollen par PCR numérique sur puce à gouttelettes naica®, avec l'identifiant 3-1 comme exemple : les combinaisons possibles de deux sondes fluorescentes permettent de distinguer les noyaux de pollen recombinants des non recombinants. (c) Vue brute du réseau de gouttelettes actives. Chaque chambre contient généralement environ 25 000 gouttelettes actives stables. Les gouttelettes ayant été amplifiées avec succès dans au moins un canal (FAM ou HEX) sont gris clair, tandis que les gouttelettes gris foncé sont négatives. (d, e) Les données de génotypage des noyaux de pollen, obtenues par le système de PCR numérique sur puce à gouttelettes naica®, sont présentées sous forme de graphiques de points. Ces graphiques représentent les noyaux de pollen issus de génotypes parentaux mélangés à parts égales (1:1) (d) et ceux issus de plantes hybrides hétérozygotes pour l'identifiant 3-1. (e) Deux populations parentales non recombinantes ont été détectées sous forme de gouttelettes ayant permis un génotypage réussi grâce à deux sondes alléliques marquées au HEX (cases vertes) ou au FAM (cases bleues). Sur le graphique de points du mélange de génotypes parentaux (d), les gouttelettes doublement positives pour le HEX et le FAM sont représentées par des cases grises (faux positifs + bruit). Chez les plantes hybrides, les gouttelettes doublement positives pour le HEX et le FAM correspondent à des populations recombinantes incluant des faux positifs et du bruit (cases rouges) (e). Les groupes (I) et (iii) représentent les gouttelettes ayant amplifié avec succès un seul marqueur.
Le système de PCR numérique sur puce à gouttelettes naica® offre une résolution extrêmement élevée, permettant ainsi d'observer les noyaux des gouttelettes ayant amplifié le marqueur (Figure 2c). Les chercheurs ont optimisé l'expérience en analysant le nombre de noyaux encapsulés et amélioré l'efficacité du génotypage par un prétraitement des noyaux de pollen avec des enzymes de restriction thermostables. Le nombre de noyaux étant directement proportionnel au nombre de gouttelettes contenant un seul noyau, un intervalle optimal pour le chargement des noyaux a été déterminé (cet intervalle variant selon les espèces et les types de noyaux).
La détection basée sur des sondes bicolores décrite dans cet article est très performante, et grâce à la plateforme à 6 couleurs, il est possible d'effectuer simultanément un plus grand nombre de génotypages, d'obtenir de multiples données de génotypage, de mesurer en parallèle le taux de recombinaison de plusieurs intervalles chromosomiques sur des chromosomes identiques ou différents, ou encore de mesurer l'intensité/la présence d'interférences CO.
De manière générale, le génotypage de noyaux de pollen d'orge uniques, basé sur le système de PCR numérique sur puce à gouttelettes naica®, permet des mesures fiables, rapides et de haute précision de la recombinaison méiotique au sein de l'intervalle chromosomique spécifié chez les plantes hybrides intraspécifiques. L'encapsulation réussie de noyaux provenant d'une gamme d'espèces présentant des noyaux et des génomes de tailles différentes démontre que la méthode proposée est largement applicable au génotypage de noyaux uniques.
Le professeur Stefan Heckmann et le docteur Yun-Jae Ahn de l'Institut Leibniz de génétique végétale et de sciences des cultures (IPK) en Allemagne ont également partagé leurs résultats de recherche en ligne. Pour mieux comprendre les détails de cet article, veuillez cliquer sur le lien suivant : https://mp.weixin.qq.com/s/KNXVs6rOt8MYpBjzuKZZ9A.
Système PCR numérique à puce à gouttelettes à six canaux naica®
Le système de PCR numérique sur puce à gouttelettes naica® à six canaux de Stilla Technologies (France) repose sur la technologie de PCR numérique sur puce à gouttelettes Crystal. Il automatise la génération et l'amplification des gouttelettes. Chaque puits d'échantillon détecte six canaux de fluorescence, identifie intelligemment les gouttelettes et effectue un contrôle qualité. La concentration absolue en nombre de copies d'au moins six gènes cibles peut être obtenue en trois heures.
