PCR numérique multiplex pour détecter le titre du nombre de copies du génome viral du virus adéno-associé recombinant (rAAV)

【Introduction】

Aperbio Xining (Jinghan) Bio et Xining (Jinghan) Bio ont uni leurs efforts pour une collaboration approfondie sur la détection par PCR numérique multiplex du titre du nombre de copies du génome viral du virus adéno-associé recombinant (rAAV). Cette collaboration performante utilise la technologie de PCR numérique Naica Crystal (cdPCR) pour optimiser la quantification du nombre de copies du génome des virus adéno-associés recombinants rAAV2 et rAAV8.

【Aperçu】

Le virus adéno-associé recombinant (rAAV) est un vecteur viral essentiel pour la thérapie génique. Les principaux défis liés au développement de ce vecteur résident dans l'optimisation des procédés en amont et en aval, ainsi que dans la standardisation des méthodes de détection pour une production à grande échelle. Parmi ces défis, le titrage précis du nombre de copies du génome du rAAV est directement lié à la posologie appropriée dans les contextes précliniques et cliniques. L'établissement d'une méthode standardisée, précise et reproductible pour quantifier le nombre de copies du génome du rAAV constitue un élément important du développement et de l'optimisation des procédés de thérapie génique. Il a été rapporté que l'utilisation de la PCR quantitative en temps réel (qPCR) pour le titrage du nombre de copies du génome du rAAV présente des problèmes tels que la complexité de l'établissement des standards et une faible répétabilité quantitative. La PCR digitale (dPCR), une technologie PCR plus récente, permet de quantifier directement le nombre de copies du génome du rAAV sans recourir à des standards ni à des courbes d'étalonnage. Il présente une tolérance élevée aux inhibiteurs et est particulièrement adapté à la détection quantitative d'échantillons de lyse virale non purifiés.

Figure 1. Production de virus adéno-associé recombinant (rAAV)

(1) Lorsque le plasmide vecteur d'expression flanqué d'ITR portant la séquence du gène cible a été co-transfecté avec

(3) le plasmide auxiliaire adénovirus dans les cellules HEK-293, l'efficacité de production du vecteur AAV était cohérente avec celle obtenue lorsque l'adénovirus était utilisé pour l'infection.

【Objectif expérimental】

Nous avons utilisé la technologie de PCR numérique Naica Crystal (cdPCR) pour optimiser la méthode de quantification simultanée du nombre de copies de trois sites géniques différents dans le vecteur plasmidique du virus adéno-associé recombinant (rAAV) et le génome viral : ITR (marqueur CY5), EGFP (GOI, marqueur HEX) et l’élément régulateur de transcription WPRE (marqueur FAM). L’analyse des données a permis de décrire et de comparer les conditions des protocoles de prétraitement de différents échantillons viraux. Il a été constaté que la linéarisation de la structure en épingle à cheveux de l’ITR et les conditions de clivage de la protéine de capside lors du prétraitement étaient particulièrement importantes pour la précision de la quantification du nombre de copies du génome viral. Ces résultats constituent la base de l’établissement d’une méthode de détection standard pour la PCR numérique dans le cadre du contrôle qualité des vecteurs viraux de thérapie génique.

【Schéma de détection quantitative du titre du nombre de copies du génome viral rAAV】