Apprenez à réaliser un test de génotypage KASP en cinq minutes à l'aide de l'instrument qPCR Pangaea.

2024-04-28

Qu'est-ce que KASP ?

La KASP (PCR compétitive spécifique d'allèle) est une nouvelle technologie de génotypage basée sur le polymorphisme nucléotidique simple (SNP). Cette technologie repose sur la lecture de la fluorescence après la réaction PCR. Chaque puits utilise une fluorescence bicolore pour détecter deux génotypes possibles pour un échantillon et un site donnés. C'est l'une des méthodes de génotypage les plus efficaces et économiques. Voyons comment réaliser un génotypage KASP avec l'instrument qPCR Pangu.

Flux de travail KASP

Étape 1 :

Concevez les sondes et amorces correspondantes. Il y a trois amorces au total : deux amorces de typage en amont avec des connecteurs fluorescents et une amorce universelle en aval (figure A ci-dessous). Il y a quatre sondes au total : deux sondes fluorescentes et deux sondes d’extinction (figure B ci-dessous). Les sondes fluorescentes et les sondes d’extinction sont complémentaires, et les sondes fluorescentes sont compatibles avec la séquence du connecteur (séquence d’étiquette) des amorces en amont spécifiques.

Étape 2 :

L'amplification par PCR est réalisée à l'aide d'un appareil qPCR. Lors de la première amplification, l'amorce spécifique de l'allèle (dont l'extrémité 3' peut être appariée) identifie la matrice allélique spécifique et achève la reconnaissance de l'allèle. L'amorce universelle inverse se lie également, complétant ainsi le processus de PCR. À ce stade, la sonde marquée par fluorescence est encore liée à sa sonde d'extinction complémentaire et aucun signal fluorescent n'est généré. À partir de la seconde amplification, une matrice portant une séquence d'étiquette universelle apparaît dans le produit. Cette étape permet l'introduction de la séquence d'étiquette universelle dans le produit de PCR correspondant au SNP. Par la suite, la sonde fluorescente est ajoutée au produit de PCR en se liant à la chaîne d'ADN complémentaire de l'étiquette, ce qui la dissocie de sa sonde d'extinction complémentaire et génère un signal fluorescent.

Comment s'assurer que la sonde et l'amorce puissent se lier comme prévu pendant le processus PCR ?

Le programme de PCR touchdown garantit la fixation séparée de la sonde et de l'amorce. À température d'hybridation élevée, l'amorce se fixe spécifiquement à la matrice grâce à sa température de fusion élevée (Tm), puis est amplifiée par l'enzyme Taq, augmentant ainsi la quantité de matrice initiale pour l'amplification par la sonde. Lorsque la température d'hybridation diminue, la sonde se fixe à la matrice et génère un signal fluorescent.

Étape 3 :

Une fois le test qPCR Pangu exécuté, obtenez les données KASP dans le menu d'analyse SNP.

Le système PCR en temps réel Pangaea facilite la détection du génotypage KASP

• La vitesse de chauffage peut atteindre 8,5℃/s, et 96 réactions de génotypage peuvent être réalisées rapidement en une seule fois et les résultats peuvent être communiqués, avec un rendement de produit élevé et une bonne spécificité.

• La précision du contrôle de température de ±0,1 °C répond aux exigences strictes de la KASP en matière de température d'amplification, garantissant la spécificité de l'identification des différences de base uniques

• Prend en charge la fonction de gradient de température à 12 colonnes, ce qui facilite l'optimisation rapide des conditions requises pour l'amplification KASP

• Détection du sommet du guide d'ondes optique, sans effet de bord ni différence de chemin optique, aucun étalonnage requis

• Canal de détection à 6 couleurs, compatible avec divers marqueurs fluorescents couramment utilisés et avec les kits de typage KASP les plus courants

Application KASP

La technologie KASP est flexible, économique et précise. Comparée à d'autres technologies, elle offre une grande flexibilité et facilite la mise en œuvre d'un criblage à haut débit et d'une détection automatisée. De plus, KASP utilise une sonde universelle compatible avec une grande variété d'amorces spécifiques de gènes, sans qu'il soit nécessaire de synthétiser des sondes pour chaque site, ce qui réduit considérablement le coût des réactifs. Cette technologie est largement utilisée dans les domaines de la sélection animale et végétale, de l'identification des ressources génétiques, de la construction de cartes génétiques et du contrôle de la pureté des semences.