La puce à gouttelettes naica® pour PCR numérique détecte l'hétéroplasmie mitochondriale après transfert nucléaire et donne des résultats en 2,5 heures.

Les maladies mitochondriales sont un type de maladie génétique causée par des mutations de l'ADN mitochondrial (ADNmt), transmises uniquement par la lignée maternelle. Généralement, des mutations affectant plus de 60 % de l'ADN mitochondrial des cellules peuvent entraîner des maladies, et plus le nombre de mutations de l'ADN mitochondrial est élevé, plus la maladie est grave.

Actuellement, le transfert nucléaire (TN), également appelé don de mitochondries, suscite un intérêt croissant en tant que stratégie de prévention de la transmission des maladies mitochondriales de la mère à l'enfant. Cependant, la présence d'une faible quantité d'ADNmt d'origine cytoplasmique lors de la transplantation nucléaire, induisant une hétérogénéité et une amplification de l'ADNmt chez le receveur, exige une quantification précise de la charge mutationnelle de l'ADNmt. Les méthodes de séquençage NGS actuelles présentent des limitations : coût élevé, durée d'acquisition importante, complexité du traitement des données et faible rapport signal/bruit.

La neuropathie optique héréditaire de Leber (LHON) est la maladie mitochondriale à transmission maternelle la plus fréquente. Une équipe d'experts du Département de biologie de l'Université de Gand, en Belgique, a utilisé la PCR digitale (dPCR) pour détecter la mutation m.11778 G>A associée à la LHON et l'a comparée au séquençage de nouvelle génération (NGS) afin d'explorer l'applicabilité de la PCR digitale à la quantification de l'hétérogénéité de l'ADN mitochondrial. Les résultats de cette recherche ont été publiés dans la revue scientifique de référence Clinical Chemistry.

Pour évaluer l'applicabilité de la dPCR dans l'évaluation de l'hétérogénéité, trois types d'échantillons ont été préparés : (i) 13 échantillons provenant de patients présentant une charge mutationnelle élevée ; (ii) Trois échantillons de type sauvage homogènes donnés par des volontaires sains ; (iii) Des échantillons traités avec NT présentent une faible charge mutationnelle due au résidu d'ADNmt, totalisant 6 échantillons.

Méthode de test :

Lors du traitement, la plage de charge mutationnelle de l'échantillon est fixée entre 50 % et 0,01 % pour l'analyse et la validation.

Conclusion expérimentale :

Les taux de mutation observés dans les résultats dPCR et NGS ont montré une bonne cohérence.

Comparativement au séquençage de nouvelle génération (NGS), la PCR numérique (dPCR) présente un bruit de fond plus faible. L'utilisation du système de PCR numérique sur puce à gouttelettes Naica® n'a révélé aucun signal positif pour les allèles mutants dans les échantillons non patients, comme prévu.

Comparativement aux résultats de la PCR digitale (dPCR), les fréquences alléliques secondaires de la quasi-totalité des échantillons hétérogènes ont été surestimées dans les résultats du séquençage de nouvelle génération (NGS). On suppose, à titre préliminaire, que des séquences incorrectes ont pu être introduites lors de l'expérience NGS, et que les fréquences alléliques secondaires ont été altérées par l'amplification PCR.

Comparée au NGS, la PCR numérique est moins coûteuse, plus simple à utiliser, donne des résultats plus intuitifs et est mieux adaptée à la détection des mutations à faible fréquence.

La méthode de PCR numérique est adaptée à la détection quantitative de l'hétérogénéité mitochondriale après transplantation nucléaire.