Sistema de PCR digital con chip de gotas naica® para la determinación de alto rendimiento de la tasa de recombinación meiótica en núcleos de polen de cebada.

7 de mayo de 2024

La meiosis sustenta la reproducción sexual mediante la producción de células haploides y variación genética basada en la recombinación homóloga (RH). La RH garantiza la segregación cromosómica meiótica a través del intercambio recombinante (CO), la sinapsis entre cromosomas homólogos, el entrecruzamiento, etc., asegurando así que la variación genética desempeñe un papel importante en la reproducción.

En las plantas, la recombinación homóloga puede detectarse mediante diversas técnicas, como la detección citológica a través del análisis de cromosomas meióticos, la genotipificación por secuenciación y marcadores moleculares o líneas marcadas con fluorescencia (FTL) en poblaciones segregantes. Las FTL son una herramienta poderosa para medir eventos de recombinación meiótica en polen o semillas de Arabidopsis. Sin embargo, las FTL no son adecuadas para cultivos, ya que su generación es laboriosa y costosa en cultivos con genomas particularmente grandes. Además, ciertos cultivos o genotipos no son aptos para la transformación genética. Como alternativa, se utiliza la genotipificación o secuenciación de microsporas (tétradas o núcleos de polen) para detectar directamente los resultados de la recombinación meiótica en los productos meióticos. No obstante, la secuenciación/genotipificación de microsporas de cultivos es bastante costosa, por lo que el número de pruebas que se pueden realizar es limitado, especialmente para especies con genomas grandes como los cereales.

La medición de la tasa de recombinación meiótica de los gametos masculinos antes de la fertilización tiene las ventajas de un gran tamaño de muestra, análisis independiente de marcadores moleculares y análisis inmediato del intercambio de recombinación, pero el contenido de ADN de los gametos es limitado, y los métodos de secuenciación/genotipado generalmente se basan en la amplificación del genoma completo (WGA). El genotipado de gametos individuales directamente a través de reacciones de PCR también es imposible debido al bajo contenido de ADN de los gametos haploides. En la cebada, el genotipado de núcleos de polen individuales se completa separando núcleos de polen haploides individuales de híbridos intraespecíficos mediante clasificación celular activada por fluorescencia, seguido de WGA y genotipado KASP multilocus o secuenciación del genoma de células individuales. El ADN de un solo núcleo de polen haploide es limitado, y el precio de la WGA es alto, lo que resulta en un número limitado de muestras analizadas y la incapacidad de completar un análisis de alto rendimiento.

Científicos del Instituto Leibniz de Genética Vegetal e Investigación de Cultivos en Alemania publicaron recientemente un artículo sobre la medición de la tasa de recombinación meiótica en la revista The Plant Journal. El artículo utiliza el sistema de PCR digital de microchips naica® para medir la tasa de recombinación meiótica en gametos y así lograr una genotipificación de alto rendimiento y bajo costo.

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Mediante el análisis de genotipado basado en el sistema de PCR digital de microchips naica®, se puede realizar una medición de alto rendimiento de las tasas de recombinación meiótica en núcleos de polen de cebada sin necesidad de realizar una gran cantidad de amplificación genómica completa (WGA) previa. Tras obtener el polen, los núcleos se extraen y purifican mediante citometría de flujo. Estos núcleos se añaden a la mezcla del sistema de PCR digital de microchips naica® para su detección y así obtener la tasa de recombinación meiótica. Al genotipar un total de más de 42 000 núcleos de polen individuales (hasta 4900 núcleos por planta), se miden las tasas de recombinación meiótica en plantas híbridas, dentro de dos centrómeros y dos intervalos cromosómicos distantes. La frecuencia de recombinación determinada en el núcleo del polen es similar a la detectada en la población segregante.

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▲ Figura 1: Flujo de trabajo para la genotipificación de núcleos de polen individuales de cebada utilizando el sistema de PCR digital naica® Droplet Chip. (a) Anteras de plantas híbridas; (b) El polen y los núcleos de polen se separan en suspensión utilizando filtros con diferentes tamaños de malla (100 y 20 μm). (c) Los núcleos de polen se tiñen con yoduro de propidio y se clasifican por flujo en la mezcla de reacción de PCR digital. (d) Se cargan 25 μl de la mezcla de reacción de PCR digital (incluidos los núcleos de polen clasificados) en una de las cuatro cámaras del chip de zafiro. (e) La generación de gotas y el ciclo térmico se realizan en Geode. (f) Después del ciclo térmico, el chip de zafiro se escaneó en naica® Prism 3 y el análisis de datos se realizó en el software Crystal Miner.

Este artículo utilizó un método de sonda dual para detectar la tasa de recombinación meiótica de los núcleos de polen. Por ejemplo, el intervalo Id 3-1 entre InDel3118 e InDel3135 detectado en la verificación de viabilidad previa se etiquetó con HEX para la sonda específica del alelo Barke (B) (verde) y con FAM para la sonda específica del alelo Morex (M) (azul) (Figura 2b). Los investigadores mezclaron núcleos de polen de genotipos parentales en una proporción 1:1 y también detectaron núcleos de polen de plantas híbridas heterocigotas para Id 3-1. En la prueba de muestra mixta parental, las gotas de los dos genotipos parentales fueron iguales y los dos marcadores mostraron la misma fluorescencia (HEX para B o FAM para M) (Figura 2b). En la detección de muestras de material híbrido, se espera que aparezcan diferentes grupos de gotas que representen eventos de recombinación, es decir, gotas que muestren dos colores al mismo tiempo (HEX para InDel3118 y FAM para InDel3135, y viceversa) (Figura 2b). En la detección real, se encontró que los genotipos parentales obtuvieron aproximadamente el mismo número de gotas, que mostraron la misma fluorescencia para los dos marcadores (Figura 2d, e, rectángulos verde y azul). En la detección de núcleos de polen de plantas híbridas, se detectaron gotas con dos colores (HEX y FAM), lo que indica eventos de recombinación (Figura 2e, rectángulo rojo). Además, se pueden distinguir gotas en las que solo se amplificó con éxito un marcador (Figura 2d, e, grupos I y iii) y gotas sin ninguna amplificación (Figura 2d, e, grupo ii). Esto demuestra que es completamente factible encapsular y genotipificar núcleos de polen individuales utilizando el sistema de PCR digital de chips de gotas naica®.

▲ Figura 2. Genotipado de núcleos de polen de cebada usando el sistema de PCR digital naica® Droplet Chip. (a) Marcadores InDel o polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) que definen cuatro intervalos cromosómicos en los cromosomas 1 y 3 de la cebada. (b) Análisis de genotipado de núcleos de polen basado en el sistema de PCR digital naica® Droplet Chip usando Id 3-1 como ejemplo: las posibles combinaciones de dos sondas fluorescentes permiten discriminar entre núcleos de polen recombinantes y no recombinantes. (c) Vista sin procesar de la matriz de gotas activas. Cada cámara contiene normalmente aproximadamente 25 000 gotas activas estables. Las gotas que se han amplificado con éxito en cualquier canal (FAM o HEX) son de color gris claro, mientras que las gotas de color gris oscuro son negativas. (d, e) Los datos de genotipado de núcleos de polen basados en el sistema de PCR digital naica® Droplet Chip de las cámaras del chip se muestran en el software como diagramas de puntos de núcleos de polen de genotipos parentales mezclados en una proporción 1:1 (d) y núcleos de polen de plantas híbridas heterocigotas con Id 3-1. (e) Se detectaron dos poblaciones parentales no recombinantes como gotas con genotipado exitoso mediante dos sondas alélicas marcadas con HEX (recuadros verdes) o FAM (recuadros azules). En el diagrama de puntos de la mezcla de genotipos parentales (d), las gotas doblemente positivas para HEX y FAM están representadas por recuadros grises como falsos positivos + ruido. Las gotas doblemente positivas para HEX y FAM en las plantas híbridas son poblaciones recombinantes que incluyen falsos positivos y ruido, mostradas como recuadros rojos (e). Los grupos (I) y (iii) representan gotas que amplificaron con éxito solo un marcador.

El sistema de PCR digital naica® Droplet Chip ofrece una resolución extremadamente alta, por lo que en las gotas que amplificaron con éxito el marcador, también se pueden observar los núcleos en su interior (Figura 2c). Los investigadores optimizaron aún más el experimento analizando el número de núcleos encapsulados en gotas y mejoraron la eficiencia de la genotipificación mediante el pretratamiento de los núcleos de polen con enzimas de restricción termoestables. Dado que el número de núcleos está directamente relacionado con el número de gotas que encapsulan un solo núcleo, se propone un intervalo óptimo para la carga de núcleos (los núcleos de diferentes tamaños varían según la especie).

La detección basada en sondas de 2 colores descrita en este artículo es muy exitosa, y mediante la plataforma de 6 colores, se pueden realizar simultáneamente más grupos de detección de genotipado, se obtendrán múltiples datos de genotipado y se podrá medir en paralelo la tasa de recombinación de más de un intervalo cromosómico en el mismo cromosoma o en cromosomas diferentes, o se podrá medir la intensidad/presencia de la interferencia de CO.

En general, la genotipificación de núcleos individuales de polen de cebada mediante el sistema de PCR digital con chip de gotas naica® proporciona mediciones de recombinación meiótica fiables, rápidas y de alta precisión dentro del intervalo cromosómico especificado en plantas híbridas intraespecíficas. La exitosa encapsulación de núcleos de diversas especies con diferentes tamaños de núcleo y genoma demuestra que el método propuesto es ampliamente aplicable a la genotipificación de núcleos individuales.

El profesor Stefan Heckmann y el Dr. Yun-Jae Ahn, del Instituto Leibniz de Genética Vegetal y Ciencias Agrícolas (IPK) en Alemania, también compartieron en línea los resultados de su investigación. Si desea comprender mejor los detalles de este artículo, haga clic en https://mp.weixin.qq.com/s/KNXVs6rOt8MYpBjzuKZZ9A para verlo.

Sistema de PCR digital de chips de gotas de seis canales naica®

El sistema de PCR digital de chips de gotas de seis canales naica® de Stilla Technologies (Francia) se basa en la tecnología de PCR digital de chips de gotas Crystal. Automatiza la generación y amplificación de gotas. Cada pocillo de muestra detecta 6 canales fluorescentes, identifica las gotas de forma inteligente y realiza el control de calidad. La concentración absoluta de copias de al menos 6 genes diana se puede obtener en 3 horas.