El sistema de PCR digital con chip de gotas naica® cuantifica con precisión los niveles de transcripción de R613X en el modelo de mutación sin sentido Scn1a del síndrome de Dravet.

28-04-2024

El síndrome de Dravet es una epilepsia genética congénita grave causada por mutaciones de novo en el gen SCN1A. Se han encontrado mutaciones sin sentido en SCN1A en aproximadamente el 20 % de los pacientes, y se han identificado mutaciones SCN1A R613X en varios pacientes. Investigadores de la Escuela de Neurociencia Sagol, el Departamento de Genética Molecular Humana y Bioquímica, y el Instituto Oftalmológico Goldschleger de la Universidad de Tel Aviv, Israel, publicaron un artículo titulado "Convulsiones inducidas por calor, mortalidad prematura e hiperactividad en un nuevo modelo de síndrome de Dravet con mutaciones sin sentido en Scn1a" en la plataforma bioRxiv.

Los autores crearon un modelo de ratón Dravet con una mutación sin sentido en el gen Scn1a. En este modelo, la mutación heterocigota Scn1a R613X provocó convulsiones espontáneas, susceptibilidad a convulsiones inducidas por calor y muerte prematura, reproduciendo así el fenotipo epiléptico característico del síndrome de Dravet. En este estudio, los autores utilizaron el sistema de PCR digital naica® Droplet Chip para la cuantificación alélica específica del ARNm de Scn1a de tipo silvestre (WT) y de la mutación R613X.

Aspectos destacados de la solicitud:

▶ El sistema de PCR digital con chip de gotas naica® cuantificó con precisión el contenido de los alelos de ARNm WT Scn1a y R613X en el modelo de ratón Dravet.

▶ En animales heterocigotos, el sistema de PCR digital naica® Droplet Chip cuantificó niveles estables de transcripción R613X en 8,9 ± 0,9 % del tipo silvestre, lo que indica que las transcripciones del alelo mutante sufren degradación de ARN mediada por codones de terminación prematura (NMD) en el tejido cortical.

Para evaluar cuantitativamente los niveles de transcritos R613X en la corteza, se utilizó el sistema de PCR digital naica® Droplet Array para detectar específicamente el gen Scn1a de tipo silvestre y el alelo R613X.

Resultados:

El sistema de PCR digital con microgotas naica® no detectó el alelo R613X en los tejidos corticales de ratones WT, lo que confirma la especificidad del método (Figura A). El alelo WT se detectó aproximadamente a la mitad del nivel en los tejidos Scn1aWT/R613X en comparación con la corteza WT, como se esperaba para los animales heterocigotos (Figura B). En los animales heterocigotos, los transcritos mutantes estables R613X fueron del 8,9 ± 0,9 % (Figura C), mucho menores que el nivel esperado del 50 %, lo que indica que los transcritos del alelo mutante sufren una fuerte degradación mediada por codones de terminación prematura (NMD) en los tejidos corticales.

▲Figura. Expresión reducida de ARNm de Scn1a en la corteza de ratones Scn1aWT/R613X. A. El tejido cortical de ratones WT no mostró transcripciones detectables del alelo R613X, lo que demuestra la especificidad de la detección de este alelo. B. En el tejido cortical de ratones Scn1aWT/R613X, el alelo Scn1a WT fue el 48,8% del presente en la corteza WT. C. La proporción de alelos R613X a WT mostró que el nivel promedio en estado estacionario del alelo Scn1a R613X en animales Scn1aWT/R613X fue del 8,9 ± 0,9% del alelo WT.

El enlace original es el siguiente: https://doi.org/10.1101/2023.02.01.526678

El sistema de PCR digital de seis canales naica® de Stilla Technologies, Francia, se basa en la tecnología de PCR digital de chips de gotas de cristal, que automatiza la generación y amplificación de gotas. Cada pocillo de muestra puede detectar 6 canales fluorescentes, identificar de forma inteligente las gotas, realizar el control de calidad y obtener la concentración absoluta de copias de al menos 6 genes diana en 3 horas.