PCR digital multiplex para detectar el título del número de copias del genoma viral del virus adenoasociado recombinante (rAAV).

【Introducción】

Aperbio Xining (Jinghan) Bio se ha unido para colaborar estrechamente en la detección mediante PCR digital multiplex del título del número de copias del genoma del virus adenoasociado recombinante (rAAV). Esta potente combinación utiliza la tecnología de PCR digital Naica Crystal (cdPCR) para optimizar el proceso de cuantificación del número de copias del genoma de los virus adenoasociados recombinantes rAAV2 y rAAV8.

【Descripción general】

El virus adenoasociado recombinante (rAAV) es un vector viral clave para la terapia génica. Los principales desafíos en el desarrollo de este vector viral provienen de la optimización de los procesos de producción y la estandarización de los esquemas de detección en la producción a gran escala. Entre ellos, la titulación precisa del número de copias del genoma del virus adenoasociado recombinante (rAAV) está directamente relacionada con la dosificación correcta en entornos preclínicos y clínicos. Establecer un método estándar, preciso y reproducible para cuantificar el número de copias del genoma del virus adenoasociado recombinante (rAAV) es una parte importante del desarrollo y la optimización de procesos en productos de terapia génica. Se ha informado que el uso de la tecnología de PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real (qPCR) para la detección de la titulación del número de copias del genoma del virus adenoasociado recombinante (rAAV) presenta problemas como el establecimiento de estándares complejos y una baja repetibilidad cuantitativa. La tecnología de PCR digital (dPCR), como nueva tecnología de PCR, puede cuantificar directamente el número de copias del genoma del virus adenoasociado recombinante (rAAV) sin depender de estándares ni curvas estándar. Presenta una alta tolerancia a los inhibidores y es especialmente adecuada para la detección cuantitativa de muestras de lisis viral sin purificar.

Figura 1. Producción de virus adenoasociado recombinante (rAAV).

(1) Cuando el plásmido vector de expresión flanqueado por ITR que contiene la secuencia del gen objetivo se cotransfectó con

(3) al introducir el plásmido auxiliar de adenovirus en células HEK-293, la eficiencia de producción del vector AAV fue consistente con la obtenida cuando se utilizó adenovirus para la infección.

【Propósito experimental】

Utilizamos la tecnología de PCR digital (cdPCR) Naica Crystal para optimizar el método de cuantificación simultánea del número de copias de tres sitios génicos diferentes en el vector plasmídico del virus adenoasociado recombinante (rAAV) y el genoma viral: ITR (marcador CY5), EGFP (GOI, marcador HEX) y el elemento regulador relacionado con la transcripción WPRE (marcador FAM). En el análisis de datos, se describieron y compararon las condiciones de los esquemas de pretratamiento de diferentes muestras virales. Se encontró que la linealización de la estructura de horquilla del ITR y las condiciones de escisión de la proteína de la cápside en el esquema de pretratamiento de la muestra viral fueron particularmente importantes para la precisión de la cuantificación del número de copias del genoma viral, proporcionando una base para el establecimiento de un método de detección estándar para el método de PCR digital en el sistema de control de calidad de vectores virales de terapia génica.

【 Esquema de detección cuantitativa para el título del número de copias del genoma viral rAAV 】