Aprende a realizar la prueba de genotipado KASP utilizando el instrumento Pangaea qPCR en cinco minutos.

28-04-2024

¿Qué es KASP?

KASP (PCR alelo-específica competitiva) es una nueva tecnología de genotipado basada en polimorfismos de un solo nucleótido (SNP). Esta tecnología se basa en la lectura de fluorescencia tras la reacción de PCR. Cada pocillo utiliza fluorescencia de doble color para detectar dos posibles genotipos de una muestra y un sitio. Es uno de los métodos de genotipado más eficientes y económicos. Veamos cómo realizar la detección de genotipado KASP utilizando el instrumento Pangu qPCR.

Flujo de trabajo de KASP

Paso 1:

Diseñe las sondas y los cebadores correspondientes. Hay tres cebadores en total: dos de tipificación aguas arriba con conectores fluorescentes y uno universal aguas abajo (Figura A). Hay cuatro sondas en total: dos fluorescentes y dos de extinción (Figura B). Las sondas fluorescentes y las de extinción son complementarias, y las sondas fluorescentes coinciden con la secuencia del conector (secuencia de etiqueta) de los cebadores aguas arriba específicos.

Paso 2:

La amplificación por PCR se realiza mediante un instrumento de qPCR. En la primera ronda de amplificación, el cebador específico del alelo (con el extremo 3' emparejado) identifica el alelo específico y completa el reconocimiento del alelo. El cebador universal inverso también se une y completa todo el proceso de PCR. En esta etapa, la sonda marcada con fluorescencia aún está unida a su sonda de extinción complementaria y no se genera señal fluorescente. A partir de la segunda ronda de amplificación, aparece en el producto una plantilla que contiene una secuencia de etiqueta universal. Este paso completa la introducción de la secuencia de etiqueta universal en el producto de PCR correspondiente al SNP. Posteriormente, la sonda fluorescente se añade al producto de PCR uniéndose a la cadena de ADN complementaria a la etiqueta, por lo que ya no se une a su sonda de extinción complementaria, generando así una señal fluorescente.

¿Cómo garantizar que la sonda y el cebador se unan como se espera durante el proceso de PCR?

Gracias al programa de PCR con temperatura de hibridación descendente, se garantiza la unión independiente de la sonda y el cebador. Cuando la temperatura de hibridación es alta, el cebador se une primero específicamente al molde debido a su elevado valor de Tm, y luego se amplifica bajo la acción de la enzima Taq, aumentando así la cantidad de molde original para la amplificación de la sonda. A medida que la temperatura de hibridación disminuye, la sonda comienza a unirse al molde y produce una señal fluorescente.

Paso 3:

Una vez realizada la prueba qPCR de Pangu, obtenga los datos KASP en el menú de análisis de SNP.

El sistema de PCR en tiempo real Pangaea ayuda a la detección de genotipado KASP.

•La velocidad de calentamiento puede alcanzar los 8,5 ℃/s, y se pueden completar rápidamente 96 reacciones de genotipado a la vez y emitir los resultados, con un alto rendimiento del producto y buena especificidad.

•La precisión del control de temperatura de ±0,1 ℃ cumple con los estrictos requisitos de KASP para la temperatura de amplificación, lo que garantiza la especificidad en la identificación de diferencias de una sola base.

• Admite la función de gradiente de temperatura de 12 columnas, lo que resulta conveniente para la optimización rápida de las condiciones requeridas para la amplificación KASP.

• Detección de la parte superior de la guía de ondas óptica, sin efecto de borde ni diferencia de trayectoria óptica, no requiere calibración.

• Canal de detección de 6 colores, compatible con varios marcadores fluorescentes de uso común y con los kits de tipificación KASP de uso común.

Aplicación KASP

La tecnología KASP es flexible, económica y precisa. En comparación con otras tecnologías, ofrece mayor flexibilidad y facilita la detección automatizada y de alto rendimiento. Además, KASP utiliza una sonda universal compatible con diversos cebadores específicos para cada gen, sin necesidad de sintetizar sondas para cada sitio específico, lo que reduce el costo de los reactivos. Esta tecnología se ha utilizado ampliamente en los campos de la mejora genética animal y vegetal, la identificación de recursos de germoplasma, la construcción de mapas genéticos y la identificación de la pureza de las semillas.