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Lebenswissenschaften
naica® Droplet Chip Digital PCR System zur Hochdurchsatzbestimmung der meiotischen Rekombinationsrate in Gerstenpollenkernen
07.05.2024
Die Meiose unterstützt die sexuelle Fortpflanzung durch die Bildung haploider Zellen und genetischer Variation auf Basis homologer Rekombination (HR). HR gewährleistet die meiotische Chromosomensegregation durch rekombinanten Austausch (CO), Synapsis zwischen homologen Chromosomen, Crossing-over usw. und trägt gleichzeitig dazu bei, dass genetische Variation eine Rolle bei der Züchtung spielt.
Bei Pflanzen lässt sich homologe Rekombination mit verschiedenen Techniken nachweisen, beispielsweise zytologisch durch Analyse meiotischer Chromosomen, Genotypisierung mittels Sequenzierung und molekularer Marker oder fluoreszenzmarkierter Linien (FTLs) in segregierenden Populationen. FTLs sind ein leistungsstarkes Werkzeug zur Messung meiotischer Rekombinationsereignisse in Pollen oder Samen von Arabidopsis. Für Nutzpflanzen sind FTLs jedoch ungeeignet, da ihre Erzeugung bei Pflanzen mit besonders großen Genomen aufwendig und kostspielig ist. Zudem eignen sich manche Nutzpflanzen oder bestimmte Genotypen nicht für die genetische Transformation. Alternativ kann die Genotypisierung oder Sequenzierung von Mikrosporen (Tetraden oder Pollenkernen) eingesetzt werden, um die Ergebnisse meiotischer Rekombination in den Meioseprodukten direkt zu erfassen. Die Sequenzierung/Genotypisierung von Mikrosporen ist jedoch recht kostspielig, sodass die Anzahl der durchführbaren Tests begrenzt ist, insbesondere bei Arten mit großen Genomen wie Getreide.
Die Messung der meiotischen Rekombinationsrate männlicher Gameten vor der Befruchtung bietet Vorteile wie große Stichprobenumfänge, unabhängige molekulare Markeranalyse und unmittelbare Analyse des Rekombinationsaustauschs. Allerdings ist der DNA-Gehalt der Gameten begrenzt, und Sequenzierungs-/Genotypisierungsmethoden basieren üblicherweise auf der Ganzgenomamplifikation (WGA). Die direkte Genotypisierung einzelner Gameten mittels PCR ist aufgrund des geringen DNA-Gehalts haploider Gameten ebenfalls nicht möglich. Bei Gerste erfolgt die Genotypisierung einzelner Pollenkerne durch Trennung haploider Pollenkerne von intraspezifischen Hybriden mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS), gefolgt von WGA und Multilocus-KASP-Genotypisierung oder Einzelzell-Genomsequenzierung. Die begrenzte DNA eines einzelnen haploiden Pollenkerns und die hohen Kosten der WGA führen zu einer begrenzten Anzahl analysierbarer Proben und verhindern Hochdurchsatzanalysen.
Wissenschaftler des Leibniz-Instituts für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung in Deutschland veröffentlichten kürzlich einen Artikel über die Messung der meiotischen Rekombinationsrate im Fachjournal „The Plant Journal“. Der Artikel beschreibt die Verwendung des digitalen PCR-Systems naica® droplet chip zur Messung der meiotischen Rekombinationsrate in Gameten, um eine kostengünstige und effiziente Genotypisierung zu ermöglichen.
Mithilfe der Genotypisierungsanalyse auf Basis des naica® Droplet-Chip-Digital-PCR-Systems lässt sich die meiotische Rekombinationsrate in Gerstenpollenkernen im Hochdurchsatzverfahren messen, ohne dass eine umfangreiche Voranalyse (WGA) erforderlich ist. Nach der Pollengewinnung werden die Pollenkerne isoliert und mittels Durchflusszytometrie gereinigt. Anschließend werden sie der Mischung des naica® Droplet-Chip-Digital-PCR-Systems zugegeben, um die meiotische Rekombinationsrate zu bestimmen. Durch die Genotypisierung von insgesamt über 42.000 einzelnen Pollenkernen (bis zu 4.900 Kerne pro Pflanze) werden die meiotischen Rekombinationsraten innerhalb zweier Centromere und zweier weit voneinander entfernter Chromosomenabschnitte in Hybridpflanzen gemessen. Die im Pollenkern ermittelte Rekombinationsfrequenz entspricht nahezu der in der segregierenden Population beobachteten Frequenz.
▲ Abbildung 1: Arbeitsablauf für die Genotypisierung einzelner Pollenkerne von Gerste mit dem naica® Droplet Chip Digital PCR System. (a) Antheren von Hybridpflanzen; (b) Pollen und Pollenkerne werden in Suspension mittels Filtern mit unterschiedlichen Maschenweiten (100 und 20 μm) getrennt. (c) Pollenkerne werden mit Propidiumiodid angefärbt und mittels Durchflusszytometrie in die digitale PCR-Reaktionsmischung überführt. (d) 25 μl der digitalen PCR-Reaktionsmischung (einschließlich der sortierten Pollenkerne) werden in eine der vier Kammern des Saphirchips pipettiert. (e) Tröpfchengenerierung und Thermocyclierung erfolgen in Geode. (f) Nach der Thermocyclierung wurde der Saphirchip mit naica® Prism 3 gescannt und die Datenanalyse mit der Software Crystal Miner durchgeführt.
In diesem Artikel wurde eine Dual-Sonden-Methode zur Bestimmung der meiotischen Rekombinationsrate von Pollenkernen eingesetzt. Beispielsweise wurde das in der vorherigen Machbarkeitsstudie identifizierte Intervall Id 3-1 zwischen InDel3118 und InDel3135 mit HEX für die Barke (B)-Allel-spezifische Sonde (grün) und mit FAM für die Morex (M)-Allel-spezifische Sonde (blau) markiert (Abbildung 2b). Die Forscher mischten Pollenkerne elterlicher Genotypen im Verhältnis 1:1 und untersuchten auch Pollenkerne von Hybridpflanzen, die heterozygot für Id 3-1 waren. Im Test mit gemischten Elternproben waren die Pollentröpfchen der beiden elterlichen Genotypen gleich groß, und die beiden Marker zeigten die gleiche Fluoreszenz (HEX für B bzw. FAM für M) (Abbildung 2b). Bei der Untersuchung von Hybridmaterialproben wird erwartet, dass verschiedene Tröpfchengruppen auftreten, die Rekombinationsereignisse repräsentieren, d. h. Tröpfchen, die gleichzeitig zwei Farben aufweisen (HEX für InDel3118 und FAM für InDel3135 und umgekehrt) (Abbildung 2b). In der Praxis zeigte sich, dass die elterlichen Genotypen annähernd gleich viele Tröpfchen mit gleicher Fluoreszenz für beide Marker aufwiesen (Abbildung 2d, e, grüne und blaue Rechtecke). Bei der Untersuchung von Pollenkernen von Hybridpflanzen wurden zweifarbige Tröpfchen (HEX und FAM) detektiert, die auf Rekombinationsereignisse hinweisen (Abbildung 2e, rotes Rechteck). Darüber hinaus lassen sich Tröpfchen unterscheiden, in denen nur ein Marker erfolgreich amplifiziert wurde (Abbildung 2d, e, Cluster I und iii), sowie Tröpfchen ohne Amplifikation (Abbildung 2d, e, Cluster ii). Dies beweist, dass die Einkapselung und Genotypisierung einzelner Pollenkerne mit Hilfe des digitalen PCR-Systems naica® droplet chip absolut machbar ist.
▲ Abbildung 2. Genotypisierung von Gerstenpollenkernen mit dem naica® Droplet Chip Digital PCR System. (a) InDel- oder SNP-Marker (Single Nucleotide Polymorphism) definieren vier chromosomale Intervalle auf den Gerstenchromosomen 1 und 3. (b) Genotypisierungsanalyse von Pollenkernen mit dem naica® Droplet Chip Digital PCR System am Beispiel von Id 3-1: Mögliche Kombinationen zweier Fluoreszenzsonden ermöglichen die Unterscheidung zwischen rekombinanten und nicht-rekombinanten Pollenkernen. (c) Rohdaten des aktiven Tröpfchen-Arrays. Jede Kammer enthält typischerweise ca. 25.000 stabile aktive Tröpfchen. Erfolgreich in einem Kanal (FAM oder HEX) amplifizierte Tröpfchen sind hellgrau, dunkelgraue Tröpfchen negativ. (d, e) Genotypisierungsdaten von Pollenkernen, basierend auf dem naica® Droplet Chip Digital PCR System aus den Chipkammern, werden in der Software als Punktediagramme von Pollenkernen elterlicher Genotypen im Verhältnis 1:1 (d) und von Pollenkernen hybrider Pflanzen, die heterozygot für Id 3-1 sind, dargestellt. (e) Zwei nicht-rekombinante Elternpopulationen wurden als Tröpfchen mit erfolgreicher Genotypisierung mittels zweier HEX-markierter (grüne Kästchen) oder FAM-markierter Allelsonden (blaue Kästchen) detektiert. Im Punktediagramm der elterlichen Genotypmischung (d) sind die HEX- und FAM-doppelpositiven Tröpfchen als falsch-positive Ergebnisse + Rauschen durch graue Kästchen dargestellt. Die HEX- und FAM-doppelpositiven Tröpfchen in den hybriden Pflanzen sind rekombinante Populationen einschließlich falsch-positiver Ergebnisse und Rauschen und werden als rote Kästchen dargestellt (e). Die Cluster (I) und (iii) repräsentieren Tröpfchen, bei denen nur ein Marker erfolgreich amplifiziert wurde.
Das naica® Droplet Chip Digital PCR System bietet eine extrem hohe Auflösung, sodass in den Tröpfchen, die den Marker erfolgreich amplifiziert haben, auch die Zellkerne innerhalb der Tröpfchen sichtbar sind (Abbildung 2c). Die Forscher optimierten das Experiment weiter, indem sie die Anzahl der in Tröpfchen eingeschlossenen Zellkerne analysierten und die Genotypisierungseffizienz durch Vorbehandlung der Pollenkerne mit thermostabilen Restriktionsenzymen verbesserten. Da die Anzahl der Zellkerne positiv mit der Anzahl der Tröpfchen korreliert, die einen einzelnen Zellkern umschließen, wird das optimale Intervall für die Beladung mit Zellkernen vorgeschlagen (die Größe der Zellkerne variiert je nach Art).
Die in dieser Arbeit vorgestellte Detektion mittels 2-Farben-Sonden ist sehr erfolgreich. Durch die weitere Entwicklung der 6-Farben-Plattform können mehr Genotypisierungsdetektionen gleichzeitig durchgeführt werden, wodurch multiple Genotypisierungsdaten gewonnen werden können. Außerdem kann die Rekombinationsrate von mehr als einem chromosomalen Intervall auf demselben oder verschiedenen Chromosomen parallel gemessen werden, ebenso wie die Intensität/das Vorhandensein von CO-Interferenzen.
Die Genotypisierung einzelner Gerstenpollenkerne mittels des digitalen PCR-Systems naica® Droplet Chip ermöglicht im Allgemeinen zuverlässige, schnelle und hochpräzise Messungen der meiotischen Rekombination innerhalb des spezifizierten chromosomalen Intervalls intraspezifischer Hybridpflanzen. Die erfolgreiche Einkapselung von Kernen verschiedener Arten mit unterschiedlichen Kern- und Genomgrößen belegt die breite Anwendbarkeit der Methode zur Genotypisierung einzelner Kerne.
Professor Stefan Heckmann und Dr. Yun-Jae Ahn vom Leibniz-Institut für Pflanzengenetik und Nutzpflanzenforschung (IPK) in Deutschland haben ihre Forschungsergebnisse ebenfalls online mit uns geteilt. Um die Details dieses Artikels besser zu verstehen, klicken Sie bitte auf https://mp.weixin.qq.com/s/KNXVs6rOt8MYpBjzuKZZ9A, um das Video anzusehen.
naica® Sechs-Kanal-Droplet-Chip-Digital-PCR-System
Das naica® 6-Kanal-Droplet-Chip-Digital-PCR-System von Stilla Technologies (Frankreich) basiert auf der Crystal-Droplet-Chip-Digital-PCR-Technologie. Es automatisiert die Tröpfchengenerierung und -amplifikation. Jede Probenvertiefung kann 6 Fluoreszenzkanäle detektieren, Tröpfchen intelligent identifizieren und eine Qualitätskontrolle durchführen. Die absolute Kopienzahlkonzentration von mindestens 6 Zielgenen kann innerhalb von 3 Stunden bestimmt werden.
