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Lebenswissenschaften
Das naica® Droplet Chip Digital PCR System quantifiziert präzise die R613X-Transkriptionsniveaus im Dravet-Syndrom-Scn1a-Nonsense-Mutationsmodell.
28.04.2024
Das Dravet-Syndrom (Dravet) ist eine schwere, angeborene, genetisch bedingte Entwicklungsepilepsie, die durch Neumutationen im SCN1A-Gen verursacht wird. SCN1A-Nonsense-Mutationen finden sich bei etwa 20 % der Patienten, und die SCN1A-R613X-Mutation wurde bei mehreren Patienten identifiziert. Forscher der Sagol School of Neuroscience, des Departments für Humangenetik und Biochemie sowie des Goldschleger Eye Institute der Universität Tel Aviv, Israel, veröffentlichten auf der Plattform bioRxiv einen Artikel mit dem Titel „Hitzebedingte Krampfanfälle, vorzeitige Sterblichkeit und Hyperaktivität in einem neuen Scn1a-Nonsense-Modell für das Dravet-Syndrom“.
Die Autoren erstellten ein Dravet-Mausmodell mit einer Nonsense-Mutation im Scn1a-Gen. Die heterozygote Scn1a-Mutation R613X führte zu spontanen Krampfanfällen, Anfälligkeit für hitzeinduzierte Krampfanfälle und vorzeitigem Tod und bildete damit den Kernphänotyp der Dravet-Epilepsie nach. In dieser Studie verwendeten die Autoren das naica® Droplet Chip Digital PCR System zur allelspezifischen Quantifizierung von WT Scn1a- und R613X-mRNA.
Anwendungshighlights:
▶ Mit dem naica® Droplet Chip Digital PCR System konnte der Gehalt an WT Scn1a und R613X mRNA-Allelen im Dravet-Mausmodell genau quantifiziert werden.
▶ Bei heterozygoten Tieren quantifizierte das naica® Droplet Chip Digital PCR System stabile R613X-Transkriptspiegel bei 8,9±0,9% des Wildtyps, was darauf hindeutet, dass Transkripte des mutierten Allels im kortikalen Gewebe einem Nonsense-vermittelten RNA-Abbau (NMD) unterliegen.
Zur quantitativen Bestimmung der R613X-Transkriptspiegel im Kortex wurde das naica® Droplet Array Digital PCR System verwendet, um WT Scn1a und das R613X-Allel spezifisch nachzuweisen.
Ergebnisse:
Das naica® Microdroplet Chip Digital PCR System konnte das R613X-Allel in kortikalen Geweben von Wildtyp-Mäusen nicht nachweisen, was die Spezifität der Methode bestätigte (Abbildung A). Das Wildtyp-Allel wurde in Scn1aWT/R613X-Geweben im Vergleich zum Wildtyp-Kortex erwartungsgemäß in etwa halber Menge nachgewiesen (Abbildung B). In heterozygoten Tieren betrug der Anteil stabiler mutierter R613X-Transkripte 8,9 ± 0,9 % (Abbildung C) und lag damit deutlich unter dem erwarteten Wert von 50 %. Dies deutet darauf hin, dass die Transkripte des mutierten Allels in kortikalen Geweben einem starken Nonsense-vermittelten mRNA-Abbau (NMD) unterliegen.
▲Abbildung. Reduzierte Scn1a-mRNA-Expression im Kortex von Scn1aWT/R613X-Mäusen. A. Im Kortexgewebe von Wildtyp-Mäusen (WT) waren keine R613X-Allel-Transkripte nachweisbar, was die Spezifität des Nachweises dieses Allels belegt. B. Im Kortexgewebe von Scn1aWT/R613X-Mäusen betrug die Menge des WT-Scn1a-Allels 48,8 % der Menge im WT-Kortex. C. Das Verhältnis von R613X- zu WT-Allelen zeigte, dass der durchschnittliche Steady-State-Spiegel des Scn1a-R613X-Allels in Scn1aWT/R613X-Tieren 8,9 ± 0,9 % des WT-Allels betrug.
Der Original-Link lautet: https://doi.org/10.1101/2023.02.01.526678
Das digitale 6-Kanal-PCR-System naica® von Stilla Technologies (Frankreich) basiert auf der Crystal-Droplet-Chip-Technologie, die die Tröpfchengenerierung und -Amplifikation automatisiert. Jede Probenvertiefung kann 6 Fluoreszenzkanäle detektieren, Tröpfchen intelligent identifizieren, eine Qualitätskontrolle durchführen und innerhalb von 3 Stunden die absolute Kopienzahlkonzentration von mindestens 6 Zielgenen bestimmen.
