Multiplex-Digital-PCR zur Bestimmung des Titers der viralen Genomkopienzahl des rekombinanten adeno-assoziierten Virus (rAAV).

【Einführung】

Aperbio Xining (Jinghan) Bio haben eine Kooperation zur intensiven Entwicklung der Multiplex-Digital-PCR-Detektion der Titerzahl des rekombinanten adeno-assoziierten Virus (rAAV) und dessen Genomkopienzahl geschlossen. Diese leistungsstarke Partnerschaft nutzt die Naica Crystal Digital-PCR-Technologie (cdPCR), um die Quantifizierung der Genomkopienzahl der rekombinanten adeno-assoziierten Viren rAAV2 und rAAV8 zu optimieren.

【Überblick】

Rekombinante adeno-assoziierte Viren (rAAV) sind wichtige virale Vektoren für die Gentherapie. Die größten Herausforderungen bei der Entwicklung dieser Vektoren liegen in der Optimierung der Upstream- und Downstream-Prozesse sowie in der Standardisierung von Nachweisverfahren für die großtechnische Produktion. Die genaue Titration der rAAV-Genomkopienzahl ist dabei direkt mit der korrekten Dosierung in präklinischen und klinischen Studien verknüpft. Die Etablierung einer standardisierten, genauen und reproduzierbaren Methode zur Quantifizierung der rAAV-Genomkopienzahl ist daher ein wichtiger Bestandteil der Prozessentwicklung und -optimierung von Gentherapieprodukten. Es wurde berichtet, dass die Verwendung der Echtzeit-Fluoreszenz-quantitativen PCR (qPCR) zur Titrationsbestimmung der rAAV-Genomkopienzahl Probleme wie die komplexe Etablierung von Standards und die geringe quantitative Reproduzierbarkeit mit sich bringt. Die digitale PCR (dPCR) ist eine neue PCR-Technologie, die die Kopienzahl des rekombinanten adeno-assoziierten Virus (rAAV)-Genoms direkt und ohne Verwendung von Standards und Standardkurven quantifizieren kann. Sie ist hochgradig tolerant gegenüber Inhibitoren und eignet sich besonders für die quantitative Bestimmung von unaufgereinigten Viruslyseproben.

Abb. 1. Herstellung von rekombinantem adeno-assoziiertem Virus (rAAV)

(1) Wenn das ITR-flankierte Expressionsvektorplasmid, das die Zielgensequenz trägt, mit

(3) Bei der Einbringung des Adenovirus-Helferplasmids in HEK-293-Zellen entsprach die Produktionseffizienz des AAV-Vektors derjenigen, die bei der Infektion mit Adenovirus beobachtet wurde.

【Experimenteller Zweck】

Wir nutzten die Naica Crystal Digital-PCR-Technologie (cdPCR), um die Methode zur simultanen Kopienzahlbestimmung dreier verschiedener Genabschnitte im rekombinanten adeno-assoziierten Virus (rAAV)-Plasmidvektor und im viralen Genom zu optimieren: ITR (CY5-Marker), EGFP (GOI, HEX-Marker) und das transkriptionsbezogene regulatorische Element WPRE (FAM-Marker). In der Datenanalyse wurden die Vorbehandlungsbedingungen verschiedener Virusproben beschrieben und verglichen. Es zeigte sich, dass die Linearisierung der ITR-Haarnadelstruktur und die Spaltungsbedingungen des Kapsidproteins in der Vorbehandlung der Virusprobe besonders wichtig für die Genauigkeit der Quantifizierung der viralen Genomkopienzahl sind. Dies bildet die Grundlage für die Etablierung einer Standardmethode zur digitalen PCR im Rahmen der Qualitätskontrolle von Gentherapie-Vektoren.

【 Quantitatives Nachweisverfahren für die Kopienzahl des rAAV-Virusgenoms 】