Lernen Sie in fünf Minuten, wie Sie den KASP-Genotypisierungstest mit dem Pangaea qPCR-Gerät durchführen.

28.04.2024

Was ist KASP?

KASP (kompetitive allelspezifische PCR) ist eine neue Genotypisierungstechnologie, die auf Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) basiert. Diese Technologie nutzt die Fluoreszenzmessung nach der PCR-Reaktion. Jede Vertiefung verwendet Zweifarbenfluoreszenz, um zwei mögliche Genotypen einer Probe an einem Ort zu detektieren. Sie zählt zu den effizientesten und kostengünstigsten Genotypisierungsmethoden. Im Folgenden wird die Durchführung der KASP-Genotypisierung mit dem Pangu qPCR-Gerät erläutert.

KASP-Workflow

Schritt 1:

Entwerfen Sie die entsprechenden Sonden und Primer. Es gibt insgesamt drei Primer: zwei typisierende Upstream-Primer mit fluoreszierenden Konnektoren und einen universellen Downstream-Primer (Abbildung A unten). Es gibt insgesamt vier Sonden: zwei fluoreszierende und zwei Quenching-Sonden (Abbildung B unten). Die fluoreszierenden und Quenching-Sonden sind komplementär, und die fluoreszierenden Sonden stimmen mit der Konnektorsequenz (Tag-Sequenz) der spezifischen Upstream-Primer überein.

Schritt 2:

Die PCR-Amplifikation erfolgt mittels eines qPCR-Geräts. Im ersten PCR-Amplifikationsschritt identifiziert der allelspezifische Primer (3'-Ende kann gepaart sein) die spezifische Allelvorlage und schließt die Allelerkennung ab. Der reverse universelle Primer bindet ebenfalls und vervollständigt den gesamten PCR-Prozess. In diesem Stadium ist die fluoreszenzmarkierte Sonde noch an ihre komplementäre Quenching-Sonde gebunden, sodass kein Fluoreszenzsignal erzeugt wird. Ab dem zweiten PCR-Amplifikationsschritt erscheint eine Vorlage mit einer universellen Tag-Sequenz im Produkt. Dieser Schritt schließt die Einführung der universellen Tag-Sequenz in das dem SNP entsprechende PCR-Produkt ab. Anschließend wird die Fluoreszenzsonde an das PCR-Produkt angehängt, indem sie an den zum Tag komplementären DNA-Abschnitt bindet. Dadurch löst sie sich von ihrer komplementären Quenching-Sonde und erzeugt ein Fluoreszenzsignal.

Wie kann sichergestellt werden, dass Sonde und Primer während des PCR-Prozesses wie erwartet binden können?

Da das Touchdown-PCR-Programm festgelegt ist, ist die separate Bindung von Sonde und Primer gewährleistet. Bei hoher Annealing-Temperatur bindet der Primer aufgrund seines hohen Schmelzpunkts (Tm) zunächst spezifisch an die DNA-Vorlage und wird anschließend unter Einwirkung des Taq-Enzyms amplifiziert. Dadurch erhöht sich die Menge der für die Sondenamplifikation verfügbaren DNA. Mit sinkender Annealing-Temperatur beginnt die Sonde an die DNA-Vorlage zu binden und erzeugt ein Fluoreszenzsignal.

Schritt 3:

Nach Durchführung des Pangu qPCR-Tests können Sie die KASP-Daten im Menü „SNP-Analyse“ abrufen.

Das Pangaea-Echtzeit-PCR-System unterstützt die KASP-Genotypisierung.

•Die Aufheizgeschwindigkeit kann 8,5℃/s erreichen, und 96 Genotypisierungsreaktionen können schnell gleichzeitig durchgeführt und die Ergebnisse können ausgegeben werden, mit hoher Produktausbeute und guter Spezifität.

• Die Temperaturgenauigkeit von ±0,1 °C erfüllt die strengen Anforderungen von KASP an die Amplifikationstemperatur und gewährleistet so die Spezifität der Identifizierung einzelner Basenunterschiede.

• Unterstützt eine 12-spaltige Temperaturgradientenfunktion, die eine schnelle Optimierung der für die KASP-Amplifikation erforderlichen Bedingungen ermöglicht.

• Optische Wellenleiter-Oberseitenerkennung, kein Kanteneffekt und keine optische Weglängendifferenz, keine Kalibrierung erforderlich

•6-Farben-Detektionskanal, unterstützt verschiedene gängige Fluoreszenzmarker und ist kompatibel mit gängigen KASP-Typisierungskits

KASP-Anwendung

Die KASP-Technologie ist flexibel, kostengünstig und präzise. Im Vergleich zu anderen Technologien bietet sie eine gewisse Flexibilität und ermöglicht einen höheren Durchsatz sowie eine automatisierte Detektion. Darüber hinaus verwendet KASP eine universelle Sonde, die in Kombination mit einer Vielzahl genspezifischer Primer eingesetzt werden kann, ohne dass für jede spezifische Stelle Sonden synthetisiert werden müssen. Dies reduziert die Reagenzienkosten des Experiments. Diese Technologie findet breite Anwendung in der Tier- und Pflanzenzüchtung, der Identifizierung von Genressourcen, der Erstellung genetischer Karten und der Bestimmung der Saatgutreinheit.