naica® Droplet Chip Digital PCR erkennt mitochondriale Heteroplasmie nach Kerntransfer und liefert Ergebnisse in 2,5 Stunden

Mitochondriale Erkrankungen sind eine Form genetischer Störungen, die durch Mutationen im mitochondrialen Genom (mtDNA) verursacht werden und ausschließlich über die weibliche Linie vererbt werden. Mutationen in mehr als 60 % der mitochondrialen DNA in den Zellen können in der Regel zu Erkrankungen führen, und je mehr mtDNA-Mutationen eine Person aufweist, desto schwerwiegender verläuft die Erkrankung.

Derzeit rückt der Kerntransfer (NT), auch bekannt als mitochondriale Spende, zunehmend in den Fokus der Forschung, um die Übertragung mitochondrialer Erkrankungen von erkrankten Müttern auf ihre Nachkommen zu verhindern. Da bei der Kerntransplantation jedoch geringe Mengen zytoplasmatischer mtDNA vorhanden sind, die die Heterogenität und Amplifikation der mtDNA im Empfänger beeinflussen, ist eine präzise Quantifizierung der mtDNA-Mutationslast erforderlich. Zu den Einschränkungen aktueller NGS-Sequenzierungsmethoden zählen hohe Kosten, langer Zeitaufwand, komplexe Datenverarbeitung und ein niedriges Signal-Rausch-Verhältnis.

Die Lebersche hereditäre Optikusneuropathie (LHON) ist die häufigste maternal vererbte mitochondriale Erkrankung. Ein Expertenteam des Fachbereichs Biologie der Universität Gent in Belgien nutzte die digitale PCR (dPCR), um die mit LHON assoziierte Mutation m.11778 G>A nachzuweisen und verglich die Ergebnisse mit der Next-Generation-Sequenzierung (NGS), um die Anwendbarkeit der digitalen PCR zur Quantifizierung der mtDNA-Heterogenität zu untersuchen. Die Forschungsergebnisse wurden in der renommierten Fachzeitschrift Clinical Chemistry veröffentlicht.

Zur Beurteilung der Anwendbarkeit der dPCR bei der Heterogenitätsbewertung wurden drei Arten von Proben erstellt: (i) 13 Proben von Patienten mit hoher Mutationslast; (ii) drei homogene Wildtyp-Proben, die von gesunden Freiwilligen gespendet wurden; (iii) mit NT behandelte Proben mit niedriger Mutationslast aufgrund von mtDNA-Resten, insgesamt 6 Proben.

Testmethode:

Durch die Verarbeitung wird der Bereich der Mutationslast der Probe für die Analyse und Validierung auf 50 % bis 0,01 % festgelegt.

Experimentelle Schlussfolgerung:

Die in den dPCR- und NGS-Ergebnissen beobachteten Mutationsraten zeigten eine gute Übereinstimmung.

Im Vergleich zu NGS weist dPCR ein geringeres Hintergrundrauschen auf. Die Verwendung des Naica® Droplet-Chip-Digital-PCR-Systems zeigte erwartungsgemäß kein positives Signal für mutierte Allele in Proben von Nicht-Patienten.

Im Vergleich zu den dPCR-Ergebnissen wurden die sekundären Allelfrequenzen fast aller heterogenen Proben in den NGS-Ergebnissen überschätzt. Es wird vorläufig vermutet, dass im NGS-Experiment fehlerhafte Sequenzen eingeführt wurden und die sekundären Allelfrequenzen durch die PCR-Amplifikation verändert wurden.

Im Vergleich zu NGS ist die digitale PCR kostengünstiger, einfacher in der Handhabung, liefert intuitivere Ergebnisse und eignet sich besser für den Nachweis von Mutationen mit niedriger Frequenz.

Die digitale PCR-Methode eignet sich zur quantitativen Bestimmung der mitochondrialen Heterogenität nach Kerntransplantation.