نظام naica® Droplet Chip Digital PCR لتحديد معدل إعادة التركيب الميوزي في نوى حبوب لقاح الشعير بكفاءة عالية

▲ الشكل 1: سير العمل لتحديد النمط الجيني لنواة حبوب اللقاح المفردة للشعير باستخدام نظام naica® Droplet Chip Digital PCR. (أ) متوك النباتات الهجينة؛ (ب) يتم فصل حبوب اللقاح ونوى حبوب اللقاح في المعلق باستخدام مرشحات ذات أحجام شبكية مختلفة (100 و20 ميكرومتر). (ج) يتم تلوين نوى حبوب اللقاح ببروبيديوم يوديد وفرزها بالتدفق في مزيج تفاعل PCR الرقمي. (د) يتم تحميل 25 ميكرولتر من مزيج تفاعل PCR الرقمي (بما في ذلك نوى حبوب اللقاح المفروزة) في إحدى حجرات شريحة الياقوت الأربع. (هـ) يتم توليد القطرات وإجراء التدوير الحراري في برنامج Geode. (و) بعد التدوير الحراري، تم مسح شريحة الياقوت ضوئيًا باستخدام برنامج naica® Prism 3، وتم تحليل البيانات باستخدام برنامج Crystal Miner.

استخدمت هذه الدراسة طريقة المجس المزدوج للكشف عن معدل إعادة التركيب الميوزي لنوى حبوب اللقاح. على سبيل المثال، تم وسم الفاصل Id 3-1 بين InDel3118 وInDel3135، الذي تم رصده في التحقق السابق من الجدوى، باستخدام HEX للمجس الخاص بأليل Barke (B) (باللون الأخضر)، وباستخدام FAM للمجس الخاص بأليل Morex (M) (باللون الأزرق) (الشكل 2ب). قام الباحثون بخلط نوى حبوب اللقاح من الأنماط الجينية الأبوية بنسبة 1:1، كما قاموا بالكشف عن نوى حبوب اللقاح من نباتات هجينة غير متجانسة الزيجوت للفاصل Id 3-1. في اختبار العينة المختلطة الأبوية، كانت قطرات النمطين الجينيين الأبويين متساوية، وأظهر المؤشران نفس الفلورة (HEX لـ B أو FAM لـ M) (الشكل 2ب). في الكشف عن عينات المواد الهجينة، من المتوقع ظهور مجموعات مختلفة من القطرات تمثل أحداث إعادة التركيب، أي قطرات تُظهر لونين في الوقت نفسه (HEX لـ InDel3118 وFAM لـ InDel3135، والعكس صحيح) (الشكل 2ب). في الكشف الفعلي، وُجد أن الأنماط الجينية الأبوية أنتجت أعدادًا متساوية تقريبًا من القطرات التي أظهرت نفس التألق للعلامتين (الشكل 2د، هـ، المستطيلان الأخضر والأزرق). في الكشف عن نوى حبوب اللقاح للنباتات الهجينة، تم الكشف عن قطرات بلونين (HEX وFAM)، مما يشير إلى أحداث إعادة التركيب (الشكل 2هـ، المستطيل الأحمر). بالإضافة إلى ذلك، يمكن تمييز القطرات التي تم فيها تضخيم علامة واحدة فقط بنجاح (الشكل 2د، هـ، المجموعتان الأولى والثالثة) والقطرات التي لم يحدث فيها أي تضخيم (الشكل 2د، هـ، المجموعة الثانية). يوضح ذلك أنه من الممكن تمامًا تغليف وتحديد النمط الجيني لنوى حبوب اللقاح المفردة باستخدام نظام تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي لرقاقة القطرات naica®.

إن الكشف القائم على المجسات ثنائية اللون في هذه الورقة ناجح للغاية، ومن خلال منصة الألوان الستة، يمكن إجراء المزيد من مجموعات الكشف عن النمط الجيني في وقت واحد، وسيتم الحصول على بيانات النمط الجيني المتعددة، ويمكن قياس معدل إعادة التركيب لأكثر من فاصل كروموسومي واحد على نفس الكروموسومات أو كروموسومات مختلفة بالتوازي، أو يمكن قياس شدة/وجود تداخل CO.

بشكل عام، يوفر التنميط الجيني لنوى حبوب لقاح الشعير المفردة، باستخدام نظام تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي بتقنية رقاقة القطرات naica®، قياسات موثوقة وسريعة وعالية الدقة لإعادة التركيب الميوزي ضمن النطاق الكروموسومي المحدد للنباتات الهجينة من نفس النوع. ويُظهر نجاح تغليف النوى من مجموعة متنوعة من الأنواع ذات أحجام النوى والجينوم المختلفة أن الطريقة المقترحة قابلة للتطبيق على نطاق واسع في التنميط الجيني للنوى المفردة.

شاركنا البروفيسور ستيفان هيكمان والدكتور يون جاي آن من معهد لايبنيز لعلم الوراثة النباتية وعلوم المحاصيل (IPK) في ألمانيا نتائج أبحاثهما عبر الإنترنت. للاطلاع على تفاصيل هذا المقال بشكل مبسط، يُرجى النقر على الرابط التالي لمشاهدته: https://mp.weixin.qq.com/s/KNXVs6rOt8MYpBjzuKZZ9A

نظام تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي ذو الشريحة القطرية سداسي القنوات من نايكا®

يعتمد نظام تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي ذو الرقاقة القطراتية سداسي القنوات naica® من شركة Stilla Technologies الفرنسية على تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي Crystal droplet chip. ويعمل هذا النظام على أتمتة توليد القطرات وتضخيمها. ويمكن لكل بئر عينة الكشف عن 6 قنوات فلورية، وتحديد القطرات بدقة، وإجراء مراقبة الجودة. ويمكن الحصول على تركيز عدد النسخ المطلق لما لا يقل عن 6 جينات مستهدفة في غضون 3 ساعات.