تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي المتعدد للكشف عن عيار عدد نسخ الجينوم الفيروسي للفيروس الغدي المرتبط المؤتلف (rAAV)

【مقدمة】

تعاونت شركة Aperbio Xining (Jinghan) Bio في مشروع بحثي معمق لتطوير تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي المتعدد (PCR) للكشف عن عدد نسخ الجينوم الفيروسي للفيروس الغدي المرتبط المُعاد تركيبه (rAAV). ويعتمد هذا التعاون الفعال على تقنية Naica Crystal الرقمية لتفاعل البوليميراز المتسلسل (cdPCR) لتحسين عملية تحديد كمية نسخ الجينوم للفيروسات الغدية المرتبطة المُعاد تركيبها rAAV2 و rAAV8.

【ملخص】

يُعد الفيروس الغدي المرتبط المُعاد تركيبه (rAAV) ناقلًا فيروسيًا رئيسيًا للعلاج الجيني. وتتمثل التحديات الرئيسية في تطوير هذا الناقل الفيروسي في تحسين عمليات الإنتاج الأولية والنهائية وتوحيد أساليب الكشف في الإنتاج على نطاق واسع. ومن بين هذه التحديات، يرتبط التحديد الدقيق لعدد نسخ جينوم الفيروس الغدي المرتبط المُعاد تركيبه (rAAV) ارتباطًا مباشرًا بالجرعة الصحيحة في البيئات ما قبل السريرية والسريرية. ويُعدّ وضع طريقة قياسية ودقيقة وقابلة للتكرار لتحديد كمية عدد نسخ جينوم الفيروس الغدي المرتبط المُعاد تركيبه (rAAV) جزءًا مهمًا من تطوير وتحسين عمليات منتجات العلاج الجيني. وقد أشارت التقارير إلى أن استخدام تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي الفلوري في الوقت الحقيقي (qPCR) للكشف عن معايرة عدد نسخ جينوم الفيروس الغدي المرتبط المُعاد تركيبه (rAAV) ينطوي على مشكلات مثل تعقيد وضع المعايير وضعف قابلية التكرار الكمي. تُتيح تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي (dPCR)، باعتبارها تقنية جديدة من تقنيات تفاعل البوليميراز المتسلسل، إمكانية تحديد عدد نسخ جينوم الفيروس الغدي المرتبط المُعاد تركيبه (rAAV) بشكل مباشر دون الحاجة إلى معايير أو منحنيات معيارية. وتتميز هذه التقنية بتحملها العالي للمثبطات، وهي مناسبة بشكل خاص للكشف الكمي عن عينات تحلل الفيروس غير المُنقّى.

الشكل 1. إنتاج الفيروس الغدي المرتبط المؤتلف (rAAV)

(1) عند نقل بلازميد ناقل التعبير المحاط بـ ITR والذي يحمل تسلسل الجين المستهدف بشكل مشترك مع

(3) البلازميد المساعد للفيروس الغدي في خلايا HEK-293، كانت كفاءة إنتاج ناقل AAV متسقة مع تلك التي تم الحصول عليها عند استخدام الفيروس الغدي للعدوى.

【غرض تجريبي】

استخدمنا تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي (cdPCR) من شركة Naica Crystal لتحسين طريقة التحديد الكمي المتزامن لعدد نسخ ثلاثة مواقع جينية مختلفة في ناقل البلازميد الفيروسي المرتبط بالغدانيات المؤتلف (rAAV) وفي الجينوم الفيروسي: ITR (علامة CY5)، وEGFP (علامة GOI، HEX)، وعنصر تنظيم النسخ WPRE (علامة FAM). في تحليل البيانات، وُصفت شروط المعالجة المسبقة لعينات فيروسية مختلفة وقورنت. وتبين أن استقامة بنية ITR الحلقية وشروط انقسام بروتين الغلاف في المعالجة المسبقة لعينة الفيروس كانا ذوي أهمية بالغة لدقة تحديد عدد نسخ الجينوم الفيروسي، مما يوفر أساسًا لوضع طريقة كشف قياسية لتقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي في نظام مراقبة جودة النواقل الفيروسية للعلاج الجيني.

【 مخطط الكشف الكمي عن عيار عدد نسخ الجينوم الفيروسي rAAV 】